Аннотация результатов, полученных в 2014 году
Проведена оценка 110 рекомбинантных инбредных хромосомных линий (RICL) и исходных родительских форм по следующим признакам: 1) устойчивость к бурой ржавчине; 2) период всходы – колошение; и 3) масса 1000 зерен. RICL были получены скрещиванием сорта мягкой пшеницы Chinese Spring (CS) с линией CS, у которой хромосома 5В замещена на хромосому 5В T. dicoccoides (CS-5Bdic). Среди всех исследованных RICL не выявлено образцов с иммунным и высокоустойчивым типом реакции на поражение патогеном бурой ржавчины. Сравнение CS и CS-5Bdic по признаку «масса 1000 зерен» не показала различий между родительскими образцами, однако, выявила значительный диапазон различий по этому признаку между отдельными линиями. Отмечены достоверные различия между линиями и по срокам колошения. По данным частичного секвенирования хромосомы 5B было разработано 115 SSR-маркеров. Девять маркеров, выявляющих полиморфизм между СS и CS-5Bdic, были локализованы на физическую карту хромосомы методом ПЦР-анализа серии перекрывающихся делеционных линий. Согласно полученным данным маркеры располагаются в делеционных бинах в следующем порядке на хромосоме от теломеры к центромере: Xicg_53 → Xicg_56, → Xicg_9 = Xicg_25 → Xicg_19=Xicg_26=Xicg_49 → Xicg_57 = Xicg_63. Проведено генотипирование 94 линий, отобранных из 110 RICL по результатам анализа фенотипических признаков. По результатам генотипирования построена генетическая карта с использованием 22 микросателлитных (SSR) маркеров, включая 5 Xicg маркеров. При этом было установлено, что каждая RICL, созданная, в результате семи поколений самоопыления, является гомозиготной. 22 из 94 изученных линий имеют единичные участки интрогрессии, что является необходимым условием для использования линий в задачах, связанных с изучением экспрессии генов. Пять Xicg маркеров были использованы для скрининга 114 пулов по 384 ВАС-клона каждый. Маркер-специфичные ВАС-клоны выявлялись с помощью двух дополнительных раундов ПЦР, следующих за отбором первичного пула. В результате картирования разработанных Xicg маркеров на генетическую и физическую карту и скрининга ВАС-клонов с использованием этих маркеров 3 суперконтига общей численностью 88 ВАС-клонов были локализованы на генетическую карту, тогда как четыре суперконтига общей численностью 143 ВАС-клона были локализованы на физическую карту. Проведено изучение аллельного разнообразия VRN1 генов у диплоидных и полиплоидных видов пшениц. Разработана и апробирована система маркеров, которая позволяет выявить изменения в основных регуляторных районах (промоторном и первом интроне) генов, влияющих на срок колошения, включая гомеологичные гены VRN-A1, VRN-B1 и VRN-D1, а также основной ген реакции на фотопериод PPD-D1. Всего проанализировано 245 преимущественно яровых сортов гексаплоидной пшеницы Европейской селекции. Были выявлены два основных гаплотипа, распространенных на юге Европы и ее оставшейся территории, соответственно. Для южной Европы характерен моногенно доминантный VRN-B1 контроль чувствительности к яровизации в сочетании с нечувствительностью к фотопериоду (гаплотип PPD-D1a vrn-A1 Vrn-B1 vrn-D1). Для центральной и северной Европы более характерно сочетание дигенного доминантного контроля яровизации и чувствительности к фотопериоду (гаплотип PPD-D1b Vrn-A1 Vrn-B1 vrn-D1). Эта же система маркеров была использована для анализа генов VRN-A1, VRN-B1 у 80 образцов T. dicoccoides из различных географических регионов. У большинства образцов, проверенных с помощью CAPS- маркеров и ПЦР анализом, промоторная область и область первого интрона не имели каких-либо изменений по сравнению с контрольными образцами, несущими рецессивные гены VRN-A1, VRN-B1. Различия отмечены только для 8 изученных образцов по гену VRN-A1. Секвенирование этих образцов показало, что у пяти образцов присутствуют аллели VRN-A1b и VRN-A1d, имеющие микроделеции в промоторной области. У трех образцов T. dicoccoides выявлена аллель VRN-A1L, для которой характерна делеция длиной 7.2 тпн в составе первого интрона. Оценка времени колошения показала, что у T. dicoccoides яровые формы ассоциировались с доминантными аллелями VRN-A1d и VRN-A1L, тогда как VRN-A1b был связан с озимым типом у всех образцов, содержащих эту аллель. Аналогичный анализ был проведен у 160 диплоидных представителей предполагаемых доноров А- генома T. dicoccoides (виды T. monococcum, T. boeoticum, T. urartu). Оказалось, что эти виды имеют собственный набор аллелей VRN-A1, отличающийся от такового у T. dicoccoides. Таким образом, анализ VRN-1 полиморфизма у диплоидных видов Triticum и тетраплоидного вида T. dicoccoides показал, что в результате формирования амфиплоида и последующей эволюции возникли новые VRN-1 аллели, которые привели к появлению яровых образцов T. dicoccoides.

Аннотация результатов, полученных в 2015 году
Triticum dicoсcoides (2n=28, геном BBAA) – первый аллополиплоид из группы пшениц, к которой относятся твердая Triticum durum и мягкая Triticum aestivum пшеницы. Проект направлен на изучение взаимосвязи между первичной структурой генов, районов их локализации и формированием ряда признаков пшеницы, играющих важную роль в ее становлении как сельскохозяйственной культуры. Основной акцент в проекте сделан на генах, локализованных на хромосоме 5В T. dicoсcoides и генах, определяющих время колошения у T. dicoсcoides и мягкой пшеницы. В 2015 году в условиях теплицы проводилась оценка влияния 3-х известных к настоящему времени аллелей VRN-А1 локуса T. dicoccoides на чувствительность к яровизации и время колошения. Один из аллелей, имеющий делецию 34 пн ранее основных функциональных сайтов промотора VRN-A1, оказался рецессивным, не оказывающим влияния на тип развития растений. Два других аллеля: VRN-A1d и VRN-A1L приводят к полному отсутствию чувствительности к яровизации и сходному, сравнительно укороченному сроку колошения - 46 дней. Такое влияние данных аллелей, по-видимому, объясняется тем, что мутации в них затрагивают важные функциональные сайты гена, а именно: делеция 32 пн у VRN-A1d затрагивает промоторный САrG-бокс, который связывает белок-регулятор, тогда как у VRN-A1L делеция перекрывает практически весь так называемый “vernalization critical region”. Для того, чтобы изучить влияние этих мутаций на транскрипцию VRN-A1 гена, а также его гомеолога - VRN-B1 мы провели ПЦР-анализ кДНК соответствующих двух образцов T. dicoccoides, несущих аллели VRN-A1d и VRN-A1L, с использованием специфических праймеров к этим генам. В результате у обоих образцов наблюдалась сходная кинетика накопления продуктов по VRN-A1 и VRN-B1 локусам c преобладанием экспрессии доминантного VRN-A1 гена. Это указывает на то, что мутации в различных регуляторных районах VRN-1 (промоторе и первом интроне) могут оказывать сходный эффект на транскрипцию этого гена и время колошения. Для изучения связи между чужеродным VRN-B1dic геном от T. dicoccoides и эффектом увеличения времени колошения у линии CS-5Bdic (Чайниз Спринг с замещением хромосомы 5В от T. dicoccoides), по сравнению с исходным сортом мягкой пшеницы Chinese Spring, нами был проведен анализ первичной структуры этих генов. Было показано, что ген VRN-B1dic содержит инсерцию трех нуклеотидов, что приводит к добавлению аминокислоты в C-терминальном районе белка. Никаких изменений уровня транскрипции в гомеологичных VRN-1 локусах у CS-5Bdic, по сравнению с CS, обнаружено не было. Для того чтобы выявить локус, определяющий различие по времени колошения, были разработаны рекомбинантные инбредные хромосомные линии (RICL), полученные от скрещивания CS и CS-5Bdic и проведена оценка их времени колошения. RICL были генотипированы с использованием Illumina Infinium 15k Wheat platform и было выявлено 379 5B-специфичных полиморфных SNP маркера. С использованием данных маркеров была построена генетическая карта, состоящая из 82 скелетных маркеров. QTL анализ позволил выявить 78 маркеров в прицентромерной области, ассоциированных с различием по времени колошения. На основании данного анализа и изучения синтении с геномами модельных злаковых растений, были идентифицированы три наиболее вероятных гена-кандидата: WRKY, ERF/AP2 and FHY3/FAR1. Для поиска новых аллелей VRN-B1, влияющих на время колошения, дополнительно было проанализировано 178 образцов шести тетраплоидных видов пшеницы (Triticum dicoccoides, T. dicoccum, T. turgidum, T. polonicum, T. carthlicum, T. durum) и пяти гексаплоидных видов (T. compactum, T. sphaerococcum, T. spelta, T. macha, T. vavilovii). Аллельные варианты гена VRN-B1 были идентифицированы, на основании изменения кривизны и гибкости ДНК молекул. Наибольшее разнообразие новых вариантов VRN-B1 (обозначены как VRN-B1.f, VRN-B1.s и VRN-B1.m) обнаружено у тетраплоидной и некоторых видах гексаплоидной пшеницы. Впервые показана корреляция между незначительными изменениями в нуклеотидной последовательности регуляторной области, известной как VRN-бокс, и типом развития пшеницы. Показано, что однонуклеотидные мутации в пределах VRN-бокса могут влиять на потребность в яровизации и тип развития пшеницы. На основании полученных данных можно предположить, что оба, А-тракт и С-богатый сегмент в пределах VRN-бокса, вносят вклад в его функциональность и меняют представление о гипотетической роли VRN-бокса в регуляции транскрипции генов VRN1. В частности, предполагается, что различные комбинации мутаций на данном участке способны модулировать чувствительность к яровизации и время цветения пшеницы. Фотопериодическая чувствительность (ФПЧ) является важным сельскохозяйственным признаком. При анализе секвенированных последовательностей родительских линий Sonora и ФЧЛ2 гена Ppd-B1 были выявлены некоторые особенности: 1) однонуклеотидная делеция в промоторной области 2) SNP в 3 экзоне, 3) SNP в промоторной области. Выявленные полиморфизмы отличают изученный аллель от аллеля Sonora64/Timstein/C591 (3 копии) и аллеля CS (4 копии), а также между родительским линиями Sonora и ФЧЛ2. Было показано, что Ppd-D1 ген Sonora содержит делецию 5 пн, характерную для IV гаплотипа Ppd-D1. Возможно, этим частично можно объяснить более позднее, чем у Sonora, выколашивание линий (они содержат Ppd-D1 от ФЧЛ2). У Ppd-A1 гена ФЧЛ2 был обнаружен не описанный ранее SNP. 5B хромосома пшеницы несет не только VRN-1 ген, но и другие значимые для сельского хозяйства гены, такие как Skr (контроль скрещиваемости с рожью), Ne1 (гибридный некроз), Ph1 (супрессор гомеологичного спаривания хромосом) и гены, определяющие устойчивость к грибным заболеваниям. Для оценки присутствия или отсутствия гена Skr у T. dicoccoides было проведено скрещивание сорта Chinese Spring и линии CS-5Bdic с рожью. Скрещиваемость определяли, как отношение количества завязавшихся зерен, к числу опыленных цветков каждого колоса, выраженное в процентах. Показано, что показатели скрещиваемости у сорта CS и линии CS-5Bdic достоверно не отличаются и варьируют в интервале от 70,68 - 73,39%. Таким образом, у вида T. dicoccoides, так же как и у мягкой пшеницы сорта CS, присутствуют гены скрещиваемости с рожью на хромосоме 5В. Гибридный некроз, проявляющийся в усыхании листьев у гибридов F1, вызывается комплементарным взаимодействием двух доминантных генов Ne1 и Ne2, картированных на хромосомах 5BL и 2BS, соответственно. Известно, что ряд образцов T. dicoccoides могут нести «слабый» аллель гена Ne1. Для проверки наличия этого гена у линии CS-5Вdic, был проведен анализ мейотической стабильности у гибридов F1, полученных от скрещивания линии CS-5Вdic с сортами, несущими «сильный» аллель гена Ne2, а именно, Гранни, Тулайковская 5, Эритроспермум С-2146. Результаты анализа мейоза у гибридов F1 сравнивались с массой тысячи зерен у гибридов и степенью проявления признаков усыхание листьев у растений. На основании сравнительного анализа для дальнейшего изучения признака гибридного некроза выбрана популяции CS-5Bdic x Гранни. Одним из подходов, направленных на изучение структурно-функционально организации геномов эукариот является изучение первичной структуры ВАС-клонов, имеющих точную локализацию на хромосоме. BAC клоны короткого плеча 5B хромосомы были собраны в 275 контигов (из них 90 – в суперконтиги) в рамках IWGSC (Международного Консорциума по Секвенированию Пшеницы). В течении этого года с помощью 71 маркера было картировано 48 суперконтигов ВАС-клонов на 5B хромосоме при использовании F2 популяции от скрещивания CS и CS-5Bdic. Два BAC-суперконтига были локализованы с использованием SNP генотипирования популяции 116 RICLs. Девять BAC-суперконтигов были локализованы на 5B хромосоме с использованием подхода GenomeZipper.

Аннотация результатов, полученных в 2016 году
Впервые проведен анализ межвидового полиморфизма гена развития HOX-1, продукт которого, как было показано ранее, влияет на длительность процесса яровизации посредством взаимодействия с продуктом VRN-1 гена. В анализ были включены образцы тетраплоидных видов T. dicoccoides (BBAA), T. araraticum (GGAA), T. timopheevii (GGAA) (49, 31 и 4 образца, соответственно), а также диплоидные виды- предполагаемые доноры А и B(G) геномов: T. monococcum (AA), T. boeoticum (AA), T. urartu (AA) и Ae. speltoides (SS) (31, 30, 40 и 23 образца, соответственно). Относительно высокий уровень полиморфизма был отмечен в промоторных районах HOX-A1 и HOX-B1 генов, причем последовательности T.dicoccoides имели более высокий уровень сходства с соответствующими последовательностями T.aestivum, чем с видами другой эволюционной линии пшениц - T.araraticum и T. timopheevii. Проанализированные промоторные последовательности HOX-1 Ae.speltoides имели 83-84% гомологии с соответствующими HOX-B1 последовательностями тетраплоидов. По сравнению с HOX-B1, промоторный район в составе гена HOX-A1 был более консервативным- 99% гомологии у полиплоидов; из диплоидных видов наибольшее сходство с полиплоидами показали последовательности T. urartu- наиболее вероятного донора А- генома по данным разных авторов. Проведен молекулярно-генетический анализ сортов твердой пшеницы (Triticum durum) по генам VRN1, VRN3 и PPD-A1. Проанализировано 134 сорта из различных эколого-географических регионов. Установлено, что сорта T. durum из России и Украины характеризуются специфическими комбинациям аллелей генов VRN, которые количественно и качественно отличаютcя от комбинаций этих аллелей, характерных для Европейских и Американских сортов твердой пшеницы. Доминантный аллель Vrn-A1a, ранее идентифицированный в гексаплоидной пшенице, обнаружен во многих сортах T. durum исключительно Российского происхождения. Кроме того, впервые, в Украинских и Российских сортах тетраплоидной пшеницы, T. durum, идентифицирован доминантный аллель гена VRN-B3 (Vrn-B3a). Проведен сравнительный анализ сортов T. durum (культурный вид тетраплоидной пшеницы) и ранее исследованных образцов T. dicoccoides (дикорастущий вид) по составу и распределению различных аллелей генов VRN-A1 и VRN-B1. Показано, что среди сортов T. durum преобладают носители доминантных аллелей гена VRN-A1, содержащие мутации в интроне 1 (в частности аллель Vrn-A1c), тогда как в образцах T. dicoccoides доминантные аллели этого гена характеризуются мутациями как в области промотора (аллели Vrn-A1b и Vrn-A1d), так и в области 1-го интрона (Vrn-A1L). Методом количественного ПЦР с использованием SYBR Green I проведена оценка уровня экспрессии генов, вовлеченных в определение времени колошения у следующих линий: 1) ранозацветающих, почти изогенных линий Ppd-m, Ppd-w и родительского сорта Sonora, несущих нечувствительный к фотопериоду аллель гена Ppd-B1a, и 2) относительно поздно переходящего к колошению родительского сорта ФЧЛ2, несущего чувствительный к фотопериоду аллель гена Ppd-B1. Были проанализированы и описаны паттерны экспрессии генов, вовлеченных в восприятие светового сигнала (PhyA, PhyB, PhyC) и генов, вовлеченных в переход к колошению (Ppd-A1, Ppd-B1, Ppd-D1, Vrn-1, TaFT1). Было показано, что Ppd-B1 экспрессировался у нечувствительных к фотопериоду линий в ночное время, что индуцировало экспрессию TaFT1. Экспрессия Vrn-1 фактически не отличалaсь у Sonora и Ppd-w, но была достоверно выше у Ppd-m. В паттернах экспрессии PhyC можно наблюдать тенденцию к усилению экспрессии данного гена у нечувствительных к фотопериоду линий и схожести паттерна экспрессии PhyC с паттерном экспрессии Ppd-B1 в ночной период (кроме ФЧЛ2, Ppd-B1 ген которого не экспрессируется ночью). Кроме того, корреляция между Ppd-B1 и PhyC была достоверной в темный период у нечувствительных к фотопериоду линий (ρ=0.62, sign=8,10796E-6, when P<0.05), что может говорить о позитивном воздействии нечувствительного к фотопериоду аллеля Ppd-B1a на экспрессию PhyC в темный период. Сдвиг пиков экспрессии у ряда генов линии Ppd-m может свидетельствовать о влиянии дополнительных факторов на паттерны экспрессии генов фотопериодического пути. Линия Ppd-m, переходящая к колошению на 3 дня ранее Ppd-w, отличается также интрогрессиями от Sonora на 4D и 5B хромосомах. Возможно, факторы, локализованные на этих хромосомах влияют на экспрессию генов фотопериодического пути. Также была проведена оценка влияния выявленных ранее нуклеотидных полиморфизмов в регуляторных и структурных районах генов Ppd-1 на экспрессию генов. Уровень экспрессии Ppd-D1 аллеля сорта Sonora, для которого характерна 5 пн делеция в 7 экзоне, более чем в 3 раза превышал уровень экспрессии данного гена у ФЧЛ2. Ген Ppd-A1 сорта ФЧЛ2, характеризующийся неописанным ранее SNP, экспрессировался несколько слабее, чем у сорта Sonora. Ранее, на материале популяции 116 RICL, полученных от скрещивания CS и CS-5Bdic, которые отличаются по времени колошения, на основании данных генотипирования и оценки времени колошения, был выявлен локус в прицентромерной области 5B хромосомы, достоверно ассоциированный с различием исследуемых линий по времени колошения. В данном участке хромосомы располагается 5 скелетных маркеров (всего 78). В результате сравнения последовательностей SNP из данного локуса с кодирующими последовательностями риса, брахиподиума, ячменя, мягкой пшеницы, T. urartu, A. taushii из баз данных, было выявлены гены, ассоциированные с маркерами из исследуемого локуса. Проанализировав консервативные домены этих генов, используя ресурсы базы данных UniProt, выявили три гена - кандидата, WRKY, ERF/AP2 и FHY3/FAR1, которые могут быть ассоциированы с различиями по времени колошения. Ранее было показано, что эти транскрипционные факторы (WRKY, ERF/AP2 и FHY3/FAR1) участвуют в регуляции времени цветения у многих растений, но данные об их участии в модуляции цветения пшеницы пока отсутствуют. Была разработана консенсусная карта 5B хромосомы с использованием генетических карт, построенных на материале трех популяций: F2 от скрещивания сортов Chinese Spring (CS) и Renan, F2 и RICL от скрещивания CS и CS-5Bdic. Консенсусная карта была построена с использованием программы MergeMap. Карта состояла из 442 SNP, SSR и ISBP маркеров (из которых 153 были скелетными), и составляла 258,16 cM. При создания консенсусной карты на основании данных генотипирования F2 и RICL популяций CSxCS-5Bdic короткого плеча 5B хромосомы для последующей локализации BAC клонов использовали программу MultiPoint Consensus. Полученная карта 5BS состояла из 53 скелетных маркеров, длина карты составляла 58,83 cM. Порядок маркеров в популяциях F2 и RICL был согласован. Картированные маркеры были распределены по бинам на основании ПЦР анализа на материале линий сорта CS с хромосомными делециями. Почти все картированные маркеры были привязаны к BAC клонам и контигам, собранным из последовательностей клонов методом фингерпринт. Интеграция BAC контигов в генетическую карту позволяет уточнить их порядок на хромосоме. Число локализованных контигов путем прямого скрининга ВАС-библиотеки с использованием дополнительного числа маркеров или на основе синтении геномов (через «zipper) позволило к 50 ВАС-контигам, локализованным на предыдущем этапе, дополнительно картировать еще 66 ВАС-контигов. По итогам работы было завершено построение физической карты хромосомы 5В.