Аннотация результатов, полученных в 2014 году
Ранее при размножении вируса Сендай на клетках почки человека или собаки было установлено, что в культуре клетки не обладают достаточной эндогенной протеазной активностью для того чтобы осуществить расщепление вирусного фузигенного белка F до активной формы F1, необходимой для проникновения вируса в клетку. Продуцируемые вирусные частицы лишены инфекционности, и поэтому для получения инфекционного вирусного стока требуется добавление экзогенного трипсина. В тоже время, известно, что вирус Сендай обладает онколитической активностью и способен разрушать опухоли как на животных моделях, так и при испытаниях на людях. В то же время, часть опухолей оказывается устойчивой к онколитическому действию вируса. Проведенные нами ранее предварительные исследования позволили предположить, что в основе чувствительности некоторых опухолей человека лежит активация эндогенных протеаз, которые способны процессировать фузигенный белок вируса Сендай и обуславливать размножение вируса в опухоли в течение нескольких инфекционных циклов. Активация эндогенных протеаз в опухолях может быть причиной для онкоселективности вируса Сендай, а предварительное выявление активации протеаз в образце опухоли пациента может позволить проведение прогнозирования по поводу индивидуальной чувствительности данной опухоли к вирусной терапии. Для проверки этой гипотезы мы провели скрининг 61 линий злокачественных клеток человека различного гистогенеза на способность продуцировать инфекционные вирионы вируса Сендай, способные к повторному заражению клеток. Было установлено, что 42 линии (68.8%) были способны продуцировать инфекционные вирионы, содержащие процессированный белок F. Среди этих линий отобраны наиболее подходящие для дальнейших исследований представители линий клеток двух типов (способные и неспособные продуцировать инфекционные вирионы). Для выявления экспрессии трансмембранных трипсин-подобных протеаз, способных осуществлять процессирование белка F, были отработаны условия для детекции транскриптов соответствующих генов с помощью ПЦР в реальном времени. Среди инфекционно-компетентных линий клеток обнаружены линии с повышением эндогенного уровня транскриптов протеазы TMPRSS2, в то время как среди инфекционно-некомпетентных линий таких изменений не выявлено. Для установления причинно-следственной связи между экспрессией протеаз и способностью продуцировать инфекционные вирионы нами были сконструированы плазмиды для выключения гена TMPRSS2 с помощью РНК интерференции (экспрессия shRNA) и геномных нокаутов (система CRISPR/Cas9). Получены данные о роли подавления гена-супрессора р53 в приобретении чувствительности клеток к вирусу Сендай. Подобраны и отработаны модели для опытом in vivo с использованием иммунодефицитных мышей, в том числе модель множественных опухолей у одного животного и их выявление с помощью компьютерной томографии. Полученные экспериментальные данные и методические разработки будут использованы на последующих этапах исследования.

Аннотация результатов, полученных в 2015 году
Определена способность 15 линий клеток опухолей человека различного гистогенеза поддерживать размножение вируса Сендай и секретировать инфекционно-компетентные вирионы. Установлена корреляция чувствительности линий с экспрессией ряда генов, относящихся к протеазным сигнальным путям. Помимо двух трансмембранных протеаз TMPRSS2 и TMPRSS11B с чувствительностью к вирусу положительно коррелировала экспрессия генов дипептидил пептидазы DPP9, карбоксипептидазы CPN1, напсина А NAPSA, катепсина К CTSK, катепсина А CTSA, протеазы PSA PROS1, аланил-аминопептизады ANPEP и карбоксипептидазы М CPM. Характер изменений активности генов протеаз зависел от тканевой принадлежности опухоли. Получено девять первичных культур (прошедших не более 6 пассирований) от пациентов рака молочной железы и шесть культур от пациентов рака простаты. Определена относительная чувствительность к вирусу Сендай внутри этой группы культур. С помощь. ПЦР в реальном времени определены уровни экспрессии 23 генов представителей протеазных сетей клетки, функционирующих во внеклеточном пространстве. Чувствительность культур достоверно положительно коррелировала с экспрессией четырех генов, кодирующих протеазу TMPRSS2 (наибольший вклад), карбоксипептидазу М СРМ, катепсин L2 CTSL2 и дипептидил пептидазу 4 DPP4. Для установления роли протеазы TMPRSS2 в чувствительности опухолевых клеток к вирусу Сендай проведено выключение этого гена с помощью РНК интерференции. Экспрессия этого гена существенно влияло на способности вируса размножаться в клетках CaCo2, но не в H1299, что указывает на ткане- и опухольспецифические различия в причинах приобретения чувствительности к вирусу. Изучена способность ряда клеток (куриные фибробласты из 5-дневных эмбрионов, периферические лимфоциты, активированные лимфоциты, индуцированные дендритные клетки, линий клеток MDCK экспрессирующая протеазу TMPRSS2) функционировать в качестве носителя для переноса вируса в чувствительные раковые клетки. Максимальной способностью заражать чувствительные клетки обладали дендритные клетки, меньшей - активированные лимфоциты, клетки куриных эмбрионов и трансгенные клетки MDCK экспрессирующие протеазу TMPRSS2, еще меньше – периферические лимфоциты крови. Проведено испытание различных способов доставки вируса в подкожные ксенографты опухолей человека на бестимусных мышах. При введении в хвостовую вену доставка была возможна с использованием 1000 зараженных вирусом клеток. Введение препаратов вируса внутрибрюшинно и подкожно оказалось малоэффективным. Установлено, что повышение чувствительности клеток рака легкого А549 к вирусу Сендай при выключении гена р53 коррелирует с увеличением экспрессии генов протеаз CPM, ANPEP, PLAU, MMP2, CPE, CPA4, ADAMTS5, TRHPE, FBXL2 и CPQ. По-видимому эти гены супрессируются р53 дикого типа, и при его утрате происходит активация транскрипции ряда протеаз, вызывая повышение чувствительности к вирусу Сендай.

Аннотация результатов, полученных в 2016 году
В течение заключительного этапа проекта по изучению роли трансмембранных протеаз в созревании онколитического вируса Сендай получены важные данные о механизме приобретения фенотипа опухолевых клеток, сопровождающегося повышенной активностью клеточных сериновых протеаз, способных процессировать F белок вируса Сендай. Вирус Сендай требует активности протеза хозяина для полного созревания и дальнейшей возможности для новообразованного вируса заражать опухолевые клетки и осуществлять онколиз. Ранее в своих исследованиях мы концентрировались на изучении изменений экспрессии самих трансмембранных протеаз в опухолевых клетках, выясняли как это коррелирует с приобретением чувствительности к вирусу и с экспрессией других генов. Однако полученные результаты были недостаточными для того чтобы делать вывод о четкой корреляции чувствительности к вирусу Сендай и изменениями экспрессии трансмембранных протеаз, по крайней мере на транскрипционном уровне. Кроме этого, применение стандартных линий опухолевых клеток имеющих разное тканевое происхождение не позволяло сделать определенные выводы, так как многие из генов могут иметь тканеспецифическую регуляцию. На данном этапе мы использовали полученную нами панель опухолевых культур ранних пассажей, полученные от пациентов рака простаты и рака молочной железы. Было исследовано 14 культур рака простаты и 8 культур рака молочной железы. Для более количественной оценки способности вируса Сендай заражать клетки нами был разработан новый количественный метод, основанный на проточной цитометрии. С помощью этого метода определена способность культур рака простаты продуцировать зрелый вирус и проведена классификация культур по их способности в той или иной степени процессировать инфекционно-активные вирионы. Во всех линиях клеток определен функциональный статус гена р53 с помощью введения р53-зависимого транскрипционного репортера и индукции активности р53 с помощью обработки 5-фторурацилом. В линиях клеток с нарушенной функциональностью р53 с помощью секвенирования фрагментов кДНК идентифицированы миссенс мутации в кодирующих участках гена р53. Наиболее характерные линии клеток, различающиеся по способности продуцировать зрелые вирионы и по состоянию гена р53 подвергнуты транскриптомному анализу. Было подтверждено, что линии клеток в большей мере способные продуцировать зрелый вирус, имеют несколько повышенный уровень экспрессии генов TMPRSS2 и TMPRSS11B. Однако наиболее сильные изменения транскрипции были обнаружены нами для генов, кодирующих ингибиторы сериновых протеаз, серпины - маспин и PAI-1. Также в клетках карциномы простаты выявлено повышение уровня экспрессии гена, кодирующего простат-специфический антиген. Интересно что два обнаруженных гена серпинов позитивно регулируются активностью гена р53. По нашим прежним опубликованным данным простат-специфический антиген находится под негативным контролем со стороны р53. Это навело на мысль что как различия в экспрессии указанных генов так и чувствительность к вирусу Сендай могут быть опосредованы статусом гена р53. Анализ экспрессии указанных генов с помощью ПЦР в реальном времени в остальных культурах опухолей простаты и молочной железы подтвердил существование строгой корреляции между экспрессией этих генов и статусом р53. Все эти три р53-регулируемых гена изменяли свою экспрессию в клетках раков простаты при выключении р53 с помощью РНК интерференции. В раках молочной железы уровни PAI-1 были существенно ниже и не регулировались р53, а уровень экспрессии PSA практически не определялся, что указывает на тканеспецифичность экспрессии этих генов. Выключение гена р53 приводило также к приобретению повышенной способности продуцировать зрелые вирионы Сендай. Таким образом мы установили, что в качестве одного из основных механизмов приобретения опухолями способности продуцировать зрелый вирус Сендай является утрата активности опухолевого супрессора р53. В результате потери функции р53 происходит утрата экспрессии ингибиторов сериновых протеаз семейства серпинов, а в случае рака простаты - к повышению экспрессии протеазы PSA. Эти изменения, очевидно, могут приводить к каскадным изменениям активности ряда протеаз, в том числе трансмембранных протеаз, принимающих участие в созревании вируса Сендай. Однако эти изменения могут плохо детектироваться на транскрипционном уровне, поскольку осуществляются за счет протеолиза. Таким образом статус гена р53 может служить одним из предикторов чувствительности опухолей человека к вирусу Сендай. Мы также провели испытание ранее разработанных нами двух клеточных моделей для системной доставки вируса Сендай в опухоли, которые основаны на клетках ранних куриных эмбрионов и индуцированных in vitro дендритных клетках человека, нагруженных предварительно вирусом Сендай. Мы установили возможность системной доставки вируса Сендай в опухоли с помощью нагруженных вирусом дендритных клеток при их внутривенном введении. Все основные цели проекта были выполнены.