Аннотация результатов, полученных в 2014 году
Участниками Проекта выполнены все задачи, поставленные на 2014 г. Осуществлены все запланированные технические и образовательные мероприятия. Проведён ряд микофлористических исследований и экспериментальных исследований, касающихся различных аспектов биоразнообразия фитопатогенных грибов. Проанализирован обширный микологический гербарный материал (421 образец), собранный ранее в Северной Осетии и Псковской области. В этих регионах нами обнаружено 129 и 122 вида микромицетов, соответственно. Из этого числа 88 видов найдены впервые в Северной Осетии и 45 – в Псковской области. Идентифицированные образцы пополнили Микологический гербарий LEP, являющийся крупнейшей коллекцией фитопатогенных грибов в России. Проведён анализ коллекции, состоящей из 41 изолята грибов рода Fusarium, 47 изолятов Ulocladium и 20 изолятов Phoma, по морфологическим, культуральным и молекулярно-генетическим признакам. Идентифицировано 14 видов, среди которых F. flocciferum является первой находкой для России. Три вида Fusarium впервые охарактеризованы по профилю микотоксинов (трихотеценовые микотоксины и зеараленон). Выявлена группа изолятов Ulocladium, филогенетически отличная от известных видов, и, возможно, представляющая собой новый вид. Проведена оценка чувствительности сорока изолятов F. langsethiae к тебуконазолу. Выявлены географические закономерности в распространении изолятов F. langsethiae, по-разному реагирующих на воздействие этого фунгицида. Получены данные по скорости роста изолятов F. langsethiae и интенсивности образования ими токсинов (Т-2 токсина и диацетоксисцирпенола) на среде с тебуконазолом. Установлено, что штаммы грибов Fusarium, выделенные из регионов, где существует высокий прессинг фунгицидов (юг России), менее чувствительны к действию тебуконазола. Проведена ревизия видового разнообразия выявленных в России видов рода Alternaria на основе анализа литературы и гербариев. Обнаружено упоминание 101 видового эпитета. Достоверными признаны сведения об обнаружении на территории страны только 31 вида Alternaria с чётким таксономическим статусом. Уточнены ареалы нескольких видов и их субстратная специализация. Установлен видовой состав грибов рода Fusarium в зерна овса из Нижегородской области и Чувашии с помощью классического микологического метода и количественной ПЦР в режиме реального времени. Определена заражённость зерна токсигенными грибами, загрязнённость основными микотоксинами, получены данные о влияние генотипа растения-хозяина (сорта) на заражённость зерна и интенсивность образования грибами микотоксинов. Выделено 189 монопустульных изолятов возбудителя бурой ржавчины (Puccinia triticina) с разных видов пшеницы и эгилопса из разных регионов России и Казахстана. Получены данные по вирулентности части этих изолятов к международному набору дифференциаторов на основе сорта Тэтчер. Отработаны методические основы для проведения SSR-анализа внутривидового разнообразия P. triticina. Проведена запланированная на 2015 г. идентификация сообществ грибов, присутствующих в образцах растительного происхождения, с применением высокоэффективного секвенирования (NGS). Тем самым отработаны методики пробоподготовки, пиросеквенирования и первичного биоинформационного анализа метагеномных данных на модельных образцах (древесный детрит). Изучен спектр биологической активности 51 изолята грибов (Phoma spp., Alternaria spp. и др.) и экстрактов из них. Обнаружены перспективные продуценты биологически активных веществ, обладающих антимикробной активностью в отношении Грам-положительных и Грам-отрицательных бактерий и дрожжевых грибов, фитотоксичностью для трудноискоренимых сорных растений (пырея ползучего, амброзии полыннолистной) и/или инсектицидной активностью против виковой тли.

Аннотация результатов, полученных в 2015 году
Участниками Проекта выполнены все поставленные на 2015 г. научные задачи, осуществлены все запланированные технические и образовательные мероприятия. Проведён ряд экспериментальных исследований, касающихся различных аспектов биоразнообразия фитопатогенных грибов, апробированы и усовершенствованы методики микологических исследований. Выполнен анализ популяций возбудителя бурой ржавчины пшеницы – гриба Puccinia triticina, собранного с 17 видов эгилопса и пшеницы разной плоидности в географически отдаленных точках России и Казахстане. Выявлено влияние плоидности растения-хозяина и места сбора на разнообразие гриба по признаку вирулентности и по микросателлитным маркерам. Например, изоляты, полученные с тетраплоидных видов, были менее вирулентны, чем с диплоидных и гексаплоидных. Выявлены также различия в фенотипическом и генотипическом составе географически отдаленных популяций. Сформулированы гипотезы для объяснения обнаруженной структуры биоразнообразия P. triticina. Изучена выборка, состоящая из 65 изолятов двух близкородственных токсигенных грибов Fusarium langsethiae и F. sibiricum, инфицирующих зерно. Оценены культурально-морфологические свойства и способность изолятов продуцировать токсины T-2 и ДАС. По этим признакам проведено сравнение обоих видов друг с другом и сравнение изолятов каждого вида из разных регионов. Показано, что в среднем, изоляты F. langsethiae образуют более высокие количества микотоксинов, по сравнению с изолятами F. sibiricum. Подобраны три пары олигонуклеотидных праймеров, специфичных к близкородственным видам, с помощью которых, используя ПЦР, можно точно определить видовую принадлежность изолятов F. langsethiae и F. sibiricum, трудно дифференцируемых по морфологическим характеристикам. Продолжена ревизия системы рода Alternaria. Для 20 изолятов рода Alternaria из секции Gypsophilae и других секций выполненные ранее исследования дополнены хемометрическим анализом. Полифазный подход позволил дифференцировать альтернариоидные грибы, изолированные из представителей семейства гвоздичные как между собой, так и от других видов Alternaria. Также с помощью комбинирования морфологических и молекулярных методов идентифицировано ещё 16 «проблемных» изолятов, отнесённых в результате к Alternaria, Alternariaster и Drechslera. Опираясь на результаты идентификации, можно говорить о нескольких микофлористических находках, новых для России и отдельных её регионов. В результате масштабного и скрупулёзного анализа литературы выявлены виды Alternaria, не попавшие ранее в молекулярно-филогенетические исследования, но соответствующие по морфологическим критериям секциям Porri, Alternaria, Panax и Gypsophilae. Это позволило к ранее включённым в эти секции видам добавить ещё 71, 38, 4 и 6 видов, соответственно. Впервые создан многовходовый политомический электронный определительный ключ для 30 наиболее распространённых видов рода Alternaria. В отношении 20 изолятов фомоидных грибов (род Phoma в широком смысле), изучение которых начато в прошлом году, проведены молекулярно-генетический и хемометрический анализы. В результате удалось чётко дифференцировать виды Boeremia exigua var, exigua, Peyronella glomerata и ряд других видов. Также изучена морфология и молекулярные маркеры для 24 других изолятов фомоидных грибов, выделенных из растений семейства Convolvulaceae. В целях определения информативности новейших молекулярных методов анализа фитопатогенной микобиоты проведено исследование зерна при помощи двух подходов: традиционного микологического и метагеномного, основанного на высокопроизводительном секвенировании ДНК (NGS). Анализ проведён на примере пяти образцов зерна ячменя до и после поверхностной стерилизации. Метагеномный анализ позволил выявить 48 операционных таксономических единиц («видов»), относящихся к 17 родам грибов, но только для 9 из них оказалось возможным провести точную вдовую идентификацию. Результаты молекулярного и классического исследования микобиоты семян ячменя в целом согласовывались друг с другом. Доминирующие группы были идентифицированы одинаково обоими методами. Отличия наблюдались при определении минорных компонентов микобиоты, особенно в зерне, не прошедшем поверхностную стерилизацию. Метагеномное исследование позволило выявить базидиальные дрожжевые грибы, которые обычно не учитываются при проведении классической фитоэкспертизы семян. Комплексный подход, основанный на анализе литературы (степень изученности биохимии разных групп грибов; частота обнаружения новых БАВ в разных таксономических и экологических группах грибов) и наличии богатой коллекции чистых культур, позволил получить несколько новых БАВ. Выделено, очищено и охарактеризовано 19 индивидуальных соединений из культур грибов. Выделенные вещества оценены на предмет возможности их практического использования. Так, показано, что феосферид А может быть использован как гербицидное соединение. Кроме того, это вещество и его синтетические производные являются ингибиторами онкогенного белка STAT3. Для пополнения гербария и коллекции чистых культур проведены экспедиционные сборы фитопатогенных грибов с сорных и дикорастущих растений в Смоленской области. В целях получения альтернативной методики длительного хранения чистых культур мицелиальных грибов было проведено апробирование методики лиофилизации с помощью сушилки FreeZone и модифицирована методика упаковывания лиофильно высушенного мицелия. Также из числа наиболее ценных чистых культур грибов, поддерживаемых в лаборатории, 96 были переданы на гарантийное хранение в криохранилище ВКСМ. Для собственных экспериментов и исследований, проводимых коллегами из других организаций, создан набор репрезентативных (типичных) культур грибов рода Fusarium, состоящий из 50 штаммов 31 вида. Для популяризации проводимых научных исследований в Лаборатории была проведена научно-производственная практика и отдельные занятия для студенческих групп из пяти вузов Санкт-Петербурга. Три исполнителя Проекта прошли обучение на двух школах-семинарах по методам определения микотоксинов и хроматографии в Москве. Принято участие в работе семи конференций и конгрессов, в т.ч. трёх зарубежных, где сделаны секционные и пленарные доклады. Опубликовано 25 печатных работ, включая монографию и 6 статей в журналах, индексируемых в WoS и Scopus.

Аннотация результатов, полученных в 2016 году
Участниками Проекта выполнены все поставленные на 2016 г. научные задачи, осуществлены все запланированные технические и образовательные мероприятия. Проведён ряд экспериментальных исследований, касающихся различных аспектов биоразнообразия фитопатогенных грибов, апробированы и усовершенствованы методики микологических исследований. Проведена экспедиция по 4 районам Краснодарского края. Собран 141 гербарный образец (поражённые растения подсолнечника, томата и многих других культу), из которого впоследствии в лаборатории было выделено порядка 500 изолятов грибов. 39 изолятов восьми родов сохранены в коллекции чистых культур Лаборатории. Исследованы сборы поражённых фитопатогенными грибами дикорастущих травянистых растений из Смоленской области, сделанные в 2015 г. Проведён анализ 130 образцов растений, относящихся к 69 видам. Идентифицировано 84 вида микромицетов из 30 родов 4 отделов. Данные по генетическому разнообразию возбудителя бурой ржавчины пшеницы – гриба Puccinia triticina, собранного с 15 видов эгилопса и пшеницы разной плоидности в географически отдаленных точках России и Казахстане, существенно дополнены в 2016 г за счёт большего количества изолятов (всего 187) и SSR-маркеров (всего 18). Определён характер влияния плоидности растения-хозяина и места сбора на фено- и генотипические особенности гриба (вирулентность и набор микросателлитных маркеров) и на структуру его популяций. Особой новизной проведенных исследований является характеристика вирулентности и полиморфизма микросателлитных локусов у обширной коллекции изолятов с видов пшеницы, ранее не изучаемых ни в России, ни за рубежом (Aegilops juvenalis, Ae. trivialis, Ae. crassa 4x, Ae. tauschii, T. compactum, T. macha, T. petropavlovskyi, T. spelta, T. sphaerococcum, T. vavilovii, T. aethiopiсum, T. turaniсum). Была проведена масштабная работа по анализу присутствующих в литературе морфологических описаний всех видов рода Alternaria (в новом широком смысле), которые имеют легитимные названия и считаются на данный момент идентифицируемыми (всего около 350). Выявлены виды Alternaria, не попавшие ранее в молекулярно-филогенетические исследования, но соответствующие по морфологическим критериям секциям Infectoria и Pseudoalternaria. В секцию Infectoria к ранее включённым в неё 25 видам добавлено ещё 9 видов. Описан новый для науки вид A. parvicaespitosa Gannibal & D.P.Lawr., который помещён в секцию Pseudoalternaria. Составлены обновлённые диагнозы обеих секций. Были изучены 20 изолятов рода Ulocladium (недавно помещённого в р. Alternaria), выделенных с различных субстратов и географически достаточно полно репрезентирующих РФ (от Северо-Запада до Кавказа и Камчатки). Секвенировано по 3 гена (Alt a1, гены кальмодулина и актина), изучены генетические (тип спаривания), морфологические, молекулярные и экологический признаки и свойства изолятов. Проведена оценка значимости каждой группы признаков для полифазной систематики. Установлено, что выборка изолятов представляет 8 видов из секций Pseudoulocladium и Ulocladioides. Как минимум один изолят может быть описан как новый для науки вид. Показано, что в этой группе грибов филогенез в целом соответствует морфологии и культуральным свойствам, однако нестабильность морфологических признаков затрудняет или практически исключают точную видовую идентификацию классическими способами. Исследовано 30 трудно идентифицируемых изолятов фомоидных грибов, выделенных из растений семейства Convolvulaceae, собранных на территории России и соседних государств. С учётом изолятов, изученных в прошлый год, получены данные по 54 изолятам. Были изучены морфологические, культуральные и молекулярно-генетические признаки. В результате изоляты были отнесены к 9 родам двух семейств Didymellaceae и Phaeosphaeriaceae. Одиннадцать изолятов оказались представителями 8 видов 3 родов. Остальные изоляты были определены до уровня рода или семейства. Некоторые из них, очевидно, являются новыми для науки видами. Проведена оценка полиморфизма трех морфологически сходных видов Fusarium (F. avenaceum, F. anguioides и F. arthrosporioides), представляющих секцию Roseum. Выполнен анализ морфологических и физиолого-биохимических признаков, полиморфизма нуклеотидных последовательностей гена бета-тубулина и ISSR-маркеров 34 изолятов. В результате таксономическая гипотеза о самостоятельности видов F. avenaceum, F. anguioides и F. arthrosporioides, описанных на основе морфологических признаков, не нашла подтверждения. Предлагается на данный момент эти морфовиды рассматривать как представителей полиморфного комплекса F. avenaceum. Были изучены биохимические и генетические особенности изолятов F. langsethiae, влияющие на жизнеспособность гриба в условиях чистой культуры. Впервые выявлено наличие у F. langsethiae природных аксотрофных мутантов. Из 49 проанализированных изолятов 24 являлись ауксотрофами по биотину и четыре – по тиамину. Это объясняет случаи обнаружения в зерне продуцируемого этим грибом Т-2 токсина при отсутствии фузариевых грибов, выявляемых микробиологическим методом. Также установлено, что делеция в локусе IGS маркирует неспособность F. langsethiae расти при высоких температурах (30 °C). Уточнены ареалы и частота встречаемости четырёх наиболее экономически значимых видов рода Fusarium (F. graminearum, F. culmorum, F. sporotrichioides и F. langsethiae), способных синтезировать микотоксины ДОН и Т-2/НТ-2. Составлены карты встречаемости образцов зерна, загрязнённого этими микотоксинами. Определена необходимость проведения мониторинговых исследований в областях, ранее не оцениваемых по контаминации зерна токсинопродуцирующими фузариевыми грибами. Изучили метаболиты 24 изолятов трех видов Alternaria. Экстракты фракционировали методом жидкостной хроматографии. Финальную очистку соединений осуществляли методом препаративной ВЭЖХ. Соединения характеризовали при помощи спектральных (одномерные и двумерные спектры ЯМР, масс-спектрометрия и другие) и биологических методов (оценка фитотоксической, антимикробной, цитотоксической активности). Установлена структура 9 соединений. Три вещества оказались ранее не описанными, два из них проявили сильную фитотоксическую и умеренную антимикробную активность. Хлорпинзелин может быть использован как хемотаксономический маркер Alternaria sonchi. Сравнили морфолого-культуральные, молекулярно-генетическим и физиолого-биохимические свойства 8 изолятов Stagonospora cirsii, выделенных из бодяка полевого и осота полевого (по 4 изолята). Между двумя группами изолятов выявлены незначительные различия по скорости роста и внешнему виду колоний. Изоляты с разных растений хозяев хорошо отличались друг от друга по метаболитным профилям, полученным при помощи ТСХ), по последовательностям гена бета-тубулина. Последовательности ITS-областей и LSU рДНК обеих групп изолятов были почти идентичны. Экстракты из культурального фильтрата изолятов S. cirsii, выделенных из осота, были токсичнее для листьев осота, чем бодяка и обладали более сильной неспецифической антимикробной активностью. Проведено секвенирование ITS2 участка грибной ДНК 5 образцов зерна ячменя из Ленинградской области при помощи секвенирования следующего поколения – NGS. Параллельно была определена микобиота зерна традиционным микробиологическим методом, путём выделения грибов в культуру на агаризованную питательную среду. Сопоставив аналогичные данные за 2015 и 2016 гг. удалось проверить эффективность ДНК-метабркодинга для микологического анализа зерна; сравнить информативность двух подходов (молекулярного и традиционного) к определению видового состава грибов в семенах растений; уточнить состав микобиоты семян ячменя в Ленинградской области, определив отдельно виды, населяющие поверхность и внутреннюю часть семян. Полученные сиквенсы были объединены в 43 операционные таксономические единицы (ОТЕ), относящиеся к сумчатым и базидиальным грибам, из числа которых 14 было идентифицировано до вида. Традиционным методом было определено 17 таксонов аскомицетов (в т.ч. 10 до уровня вида). Оба перечня таксонов совпадали лишь частично. Сделан вывод о том, что наиболее достоверные и детальные сведения о микобиоме могут быть получены только при комбинировании нескольких способов анализа. Благодаря ДНК-метабаркодингу были найдены виды, ранее не обнаруженные на ячмене в России. Проведено сравнение эффективности методов выявления зараженности зерна грибами (на примере заражённости 16 образцов овса и пшеницы грибами рода Fusarium): традиционного микологического и новейших молекулярных количественных методов (ПЦР в реальном времени и цифровая ПЦР). Впервые показано, что по чувствительности определения количества целевой ДНК в материале, эти методы сопоставимы, однако цифровая ПЦР не требует подготовки стандарта искомой ДНК с точно известной концентрацией. Отсутствие этого дополнительного этапа значительно упрощает процедуру анализа и расширяет круг испытательных лабораторий, в которых могут выполнять подобного рода исследования. Для популяризации проводимых научных исследований в Лаборатории были проведены экскурсии и занятия для студентов из четырёх вузов Санкт-Петербурга. Принято участие в работе 14 конференций и конгрессов, в т.ч. четырёх зарубежных, где сделаны инициативные и приглашённые доклады. Опубликовано 16 печатных работ, включая монографию и 7 статей в журналах, индексируемых в WoS и Scopus.