КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 14-44-00022

НазваниеМеханизмы регуляции стрессового ответа на обезвоживание в клетках и тканях хирономиды P. vanderplanki

РуководительKikawada Takahiro , Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регионфедеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Казанский (Приволжский) федеральный университет", Республика Татарстан

Года выполнения при поддержке РНФ2014 - 2016

КонкурсКонкурс 2014 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований международными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-201 - Структурная, функциональная и эволюционная геномика

Ключевые словаангидробиоз, транскрипция, устойчивость к обезвоживанию, хирономиды, геном, экспрессия генов, регуляция экспрессии, РНК интерференция, транскриптом, протеом, некодирующие РНК,Кэп-анализ экспрессии генов (CAGE)

Код ГРНТИ34.15.29, 34.15.61, 34.03.23


СтатусУспешно завершен


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
Способность личинок африканской хирономиды P. vandeplanki выживать в условиях полного обезвоживания является уникальным примером эволюции систем адаптации к экстремальным условиям среды (ангидробиоз). Этот организм является единственным известным представителем группы насекомых и самым высокоорганизованным среди других ангидробионтов (тихоходок, артемий, коловраток), способным переживать высыхание. Сравнительный анализ генома экстремальной хирономиды P. vanderplanki с родственным видом (P. nubifer) и другими видами насекомых позволил выявить ряд особенностей: богатство ГЦ-пар, наличие уникальных генов, свойственных растениям и нехарактерных для насекомых, формирование «островков ангидробиоза», где мультиплицированы гены стрессового ответа. Целью данного проекта является создание «дорожной карты» органо- и ткане- специфичной экспрессии стрессовых белков в условиях обезвоживания, включая идентификацию активности промоторов и некодирующих РНК участвующих в регуляции ангидробиоза. Показано, что в геноме хирономиды подверглись значительной мультипликации гены Lea белков (Late embryogenesis abundant proteins), L-изоаспартат-метил-трансфераз (PIMT в международной аббревиатуре), супероксиддисмутаз (SOD), тиоредоксинов (Trx), глобинов. Lea белки являются типичными для растений и их наличие в геноме P. vanderplanki – единственный пример среди насекомых. Более того, в геноме хирономиды обнаружено более 25 lea-генов, что значительно выше таковых даже у растений. Метилтрансферазы встречаются во всех геномах высших эукариот, однако у млекопитающих и насекомых представлены единственным геном, у растений – двумя генами. У хирономиды обнаружено 14 генов PIMT, что является уникальным как для насекомых, так и для живых организмов в целом. В дополнении к двум классическим цитоплазматическим и одной митохондриальной супероксиддисмутазе в геноме P. vanderplanki обнаружено 2 дополнительных гена Zn-Cu SOD, причем структурно отличающихся от классических. Другим антиоксидантом, по-видимому вовлеченным в процесс ангидробиоза, являются тиоредоксины (trx). У животных встречается до 5ти генов тиоредоксинов, у растений – до 30ти. В отличие от животных, включая насекомых, для которых характерно наличие 3х генов тиоредоксинов геноме, у спящей хирономиды обнаружено 24 гена trx. Таким образом, перед научным сообществом встает целый ряд вопросов: почему в геноме ангидробиотического насекомого произошла мультипликация перечисленных генов? Является ли экспрессия этих генов ткане- или органо- специфичной? Каков минимальный набор генов, необходимый для формирования устойчивости к обезвоживанию? В связи с этим, в данном проекте будет решаться задача оценки транскрипционной активности генов в отдельных органах и тканях личинки спящей хирономиды (методом RNA-seq). На следующем этапе работы будет предпринята попытка установить закономерности регуляции индукции устойчивости. В частности, будут идентифицированы промоторы, активность которых связана с обезвоживанием, а также вовлеченность некодирующих РНК в инициацию ангидробиоза (методом CAGE). Наряду с исследованием тканеспецифичности стрессовых белков и регуляторных элементов в личинках насекомого, будет проведен сходный анализ с использованием культуры клеток этого насекомого в нормальных условиях, при обезвоживании и после регидратации. Сравнительный анализ полученных данных позволит приступить на третьем этапе проекта к in vivo экспериментам, направленным на контролируемую индукцию ангидробиоза в культуре клеток (методом РНК-интерференции). Ранее, на основе анализа библиотек EST было показано, накопление транскриптов генов ангидробиоза (Lea белков, PIMT, антиоксидантов). Аккумуляция мРНК этих генов происходит в течение 48 часов перед наступлением полного ангидробиоза, после наступления которого метаболическая активность не регистрируется. Кроме того, показано, что потеря воды вызывает значительное повреждение ДНК, структура которой восстанавливается только через два дня после регидратации (Gusev et al., 2010). Вероятно, транскрипция в первые часы после регидратации (возможно и вплоть до полной репарации ДНК) невозможна и часть транскриптов, накопленная во время подготовки к ангидробиозу, необходима для восстановления метаболизма. Мы предполагаем двукомпонентность молекулярного ответа на обезвоживание: происходит активный синтез защитных белков (в т.ч. шаперонов) для предотвращения агрегации и повреждения биомолекул, а также запасание РНК, необходимой на этапе регидратации. Для проверки данной гипотезы, в рамках проекта будет проведен полных протеомный анализ на разных стадиях высыхания и регидратации (методом iTRAQ) в ряде органов хирономиды. Данный подход позволит установить взаимосвязь процессов транскрипции и трансляции в полном цикле ангидробиоза и последующей регидратации. Таким образом, выполнение проекта позволит значительно расширить фундаментальные знания о механизмах устойчивости живых организмов к стрессу, в частности к обезвоживанию. Во-первых, будет установлена тканеспецифичная экспрессия генов устойчивости; во-вторых, будут установлены закономерности регуляции процесса, включая идентификацию специфичных промоторов стресса и некодирующих РНК; в-третьих, будет получен профиль экспрессии генов в культуре клеток насекомого, способной переносить высушивание; в-четвертых, будет получен протеомный профиль экспрессии генов при ангидробиозе и последующем восстановлении метаболизма после добавления воды.

Ожидаемые результаты
1. Впервые будет установлены закономерности экспрессии стрессовых генов в отдельных органах и тканях личинки спящей хирономиды в ответ на потерю воды и последующую реактивацию в процессе регидратации. Подобный анализ позволит выявить конкретные гены среди целой группы ответственны за защиту специализированных клеток (например, клеток нервной системы, клеток жирового тела, репродуктивной системы, мышц). 2. Будут идентифицированы протомоторы и регуляторные молекулы (белковые или некодирующие РНК) активность которых связана ангидробиозом. 3. Будет исследована экспрессия генов на разных стадиях обезвоживания и регидратации в культуре клеток, способной к полному обезвоживанию. Данный этап необходим для последующего создания методов направленного повышения устойчивости к обезвоживанию в культурах клеток млекопитающих, в .т.ч. человека. 4. Будет установлена роль регуляторных элементов в устойчивость in vivo с использованием культуры клеток насекомого и технологии РНК интерференции. 5. Впервые для животных- ангидробионтов, будет проведен протеомный анализ на разных стадиях десикации и последующей регидратации и установлена взаимосвязь транскрипции и трансляции в полно цикле ангидробиоза. В результате выполнения данного проекта будут получены новые фундаментальные знания о механизмах устойчивости высших эукариот к полной потере воды. Полученные данные будут служить также основой перехода от фундаментальных знаний к практической реализации новых биотехнологий (созданию протоколов безводного хранения биоматериала).


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2014 году
На базе лаборатории в КФУ оптимизированы условия поддержания клеточной линии Pv11 способной к индуцируемому ангидробиозу. Был опробованы ряд сред и сделан вывод, что среда IPL является наиболее подходящей для поддержания культуры клеток и инициации в них ангидробиоза. Осуществлено секвенирование генома клеточной линии Pv11 хирономиды с использованием двух подходов спаренных прочтений: paired ends (PE) и mate pairs (MP). С использованием комбинации специализированного ПО и различных методик олучена более точная и целостная сборка генома клеточной культуры хирономиды (значение N50 увеличено более чем в 2 раза). Установлено, что геном клеточной линии отличается от генома личинок на 1-2% на нуклеотидном уровне. С использованием новых данных mRNASeq было идентифицировано 27 новых кодирующих белки генов не описанных в изначальной версии расшифровки генома хирономиды. На основе новых данных о структуре генома клеточной культуры Pv11 и анализа экспрессии мРНК (методом SE mRNA-Seq) были получены полногеномные профили экспрессии для каждой стадии цикла ангидробиоза. Результаты оказались достаточно неожиданными: детальный анализ экспрессии 132 генов, активность которых непосредственно в личинках связана с процессом ангидробиоза (LEA белки, белки теплового шока, ферменты синтеза трегалозы, антиоксиданты и др) показал, что сходная по динамике и интенсивности экспрессия этих генов в клетках Pv11 инициируется уже на стадии преинкубации с трегалозой еще до начала обезвоживания.Анализ данных экспрессии генов расположенных в ARIds (участки генома содержащие кластеры генов-паралогов, активность которых определяет успешность ангидробиоза, см. Gusev et.al, 2014) показал что лишь часть из этих генов экспрессируется в клетках Pv11 в гидратированном состоянии и повышает экспрессию в ответ на обезвоживание. Таким образом, можно сделать вывод, что одной из характеристик ARIds и генов находящихся в них является ткане-специфичность. И, вероятно, активная паралогизация генов связанных с ангидробиозом связана с их “специализацией” на определенном типе клеток или тканей. Произведена подготовка библиотек для CAGE анализа из общей РНК клеток Pv11 на разных этапах ангидробиоза в трех биологических повторностях. Данные (по 30-45 миллионов прочтений в каждой библиотеке) картированы на геном Pv11 и интегрированы в браузер ZENBU для выделения специфичных для цикла регуляторных элементов, включая энхансерные РНК и промотеры.К моменту отчета выделено 17 типов (многокопийных, высоко-консервативных, 500-800 п.н.) некодирующих РНК активность которых сопряжена со стадиями ангидробиоза. Предварительный анализ промотерной активности генов в ARIds участках генома свидетельствует о дифференциальных сайтах инициации транскрипции в зависимости от стадии цикла ангидробиоза.

 

Публикации


Аннотация результатов, полученных в 2015 году
На 2015 год были запланированы ключевые эксперименты по профилированию экспрессионной активности регуляторных элементов в тканях хирономид и клеточной культуре Pv11 полученной из эмбриональной клеточной массы хирономид. На конец 2015 были выполнены все работы по проекту, а также проведен ряд дополнительных экспериментов, что позволило создать более целостную картину процессов связанных с ангидробиозом в клетках и тканях хирономиды. Были подобраны наиболее перспективные в качестве модельных ткани хирономиды для полногеномного и протеомного анализа. Это – жировое тело, кишечник, нервная трубка. Были получены полногеномные профили экспрессии мРНК в выбранных органах хирономиды на активной стадии и после 24 часов медленного обезвоживания (это точка, когда генетические процессы связанные с ангидробиозом полностью активирутся, но в то же время в теле личинок присутствует еще значительное количество воды, так что извлечение органов не сопряжено с повреждением последних). Показано, что значительная часть из 17154 генов в геноме хирономиды является тканеспецифичными. Среди тканей, наиболее большое количество дифференциально экспрессирующихся генов (P<0.05 среднее в трех повторностях) в ответ на обезвоживание было обнаружено в нервной системе (780 различных транскриптов). Анализ экспрессии 27 генов кодирующих Lea белки в хирономиде показал, что часть из них ( в том числе PvLea4, PvLea3, PvLea6, PvLea11) экспрессируются на высоком уровне во всех исследованных тканях, и, в то же время их экспрессия дополнительно индуцируется обезвоживанием. В то же время, экспрессия ряда других PvLea генов носила более тканеспецифичный характер. Схожие паттерны наблюдались и в группах генов кодирующих антиоксиданты, в частности тиоредоксины. Был продолжен анализ экспрессионной активности (с учетом новых данных по методике CAGE) в клеточной культуре Pv11. Основная массаа дифференциально экспрессирующихся CAGE кластеров приходилось на период преинкубации клеток с трегалозой, и регидратации после полностью безводного состояния, в то время как период непосредственно процесса обезвоживания характеризовался значительно меньшим изменением экспрессии генов. Мы отметили факт того что бОльшая часть генов показывающая дифференциальную экспрессию хотя бы на одной стадии ангидробиоза характеризуется двумя пиками сайтов инициации транскрипции и на разных стадиях ангидробиоза “соотношение” интенсивности пиков значительно изменяется. Это дает основание предположить существование особых транскрипционных факторов, активность которых связана с изменением концентрации трегалозы, либо c процессом обезвоживания. Кроме того мы выделили ряд некодирующих РНК экспрессирующихся на мультикопийных участках генома хирономиы и обладающих признаками регуляторных (в том числе и энхансерных РНК), - экспрессия которых прямо или обратно коррелирует с активностью генов известных участников ангидробиза, а также экспрессирующихся в участках обладающими свойствами энхансерных зон в геноме хирономиды. Эти РНК будут являться кандидатными целями для in vitro экспериментов. Cравнительный анализ размера геномов хирономид и структуры хромосом P.vanderplanki из различных популяций показал признаки значительных изменений в структуре генома (а также появления ряда новых микро-морфологических признаков) в разных популяциях хирономид. Одним из возможных катализаторов этого процесса может являться процесс повреждения ДНК при ангидробиозе, в том числе генерирующих полиморфные участки в регуляторных областях генома. Был получен профиль распространения белков в клеточной культуры Pv11 на разных этапах цикла ангидробиоза: лабораторный контроль, клетки после 48 часов инкубации с трегалозой, полностью обезвоженные клетки и клетки через 24 часа после регидратации (только живые клетки). В результате был идентифицирован 19001 пептид предствляющий 408 белков, динамика распространенности которых были проанализированы во четырех группах образцов. По результатам соотнесения белкового и РНК профилей наблюдалась значительная корреляция высокоэкспрессирующихся РНК и их белковых продуктов. Были обнаружено присутствие высоких концентрация PvLEA4 и PvLea11 белков, а также ряда тиоредоксинов и других антиоксидантов, что предоставило уникальную информацию о фактическом распространении белковых компонентов в клетках с формирующимся “молекулярным щитом”. На основании полученных данных готовится рукопись статьи о динамике изменения транскрипционного, метаболомного и белкового профилей в клеточной культуре Pv11 в цикле ангидробиоза В соответствии с условиями РНФ проведены два международных семинара с элементами молодежной школы (июль 2015, Москва : http://kpfu.ru/biology-medicine/struktura-instituta/openlab/extreme-biology-lab/novosti/seminar-s-elementami-shkoly-39funkcionalnaya_137652.html и август 2015, Иркутск: http://kpfu.ru/news/seminar-s-elementami-shkoly-39funkcionalnaya_141092.html) ориентированные на полногеномный анализ в экстремофильных организмах, в частности с применением различных методов анализа транскрипционной активности генома. По ключевым результатам опубликованы две статьи и еще четыре рукописи рассматриваются редакциями профильных журналов для публикации.

 

Публикации

1. Ninel A. Petrova, Richard Cornette, Sachiko Shimura, Oleg H. Gusev, Dylo Pemba, Takahiro Kikawada, Sergey V. Zhirov, Takashi Okuda Karyotypical characteristics of two allopatric African populations of anhydrobiotic Polypedilum Kieffer, 1912 (Diptera, Chironomidae) originating from Nigeria and Malawi Comparative Cytogenetics, 9 (2): 173-188 (год публикации - 2015).

2. R. Cornette, O.Gusev, Y. Nakahara, S. Shimura, T. Kikawada and T. Okuda Chironomid Midges (Diptera, Chironomidae) Show Extremely Small Genome Sizes Zoological Science, Zoological Science 32(3):248-254. (год публикации - 2015).


Аннотация результатов, полученных в 2016 году
На данном этапе проекта, нам удалось показать, что, как и предполагалось по данным биоинформатического анализа, фактор теплового шока является одним из ключевых регуляторов активации транскрипции в ответ на обезвоживание в клетках хирономиды. Результаты направленного подавления активности транскрипционного фактора теплового шока (HSFT) показали значительное снижение выживаемости и общую низкую пролиферацию клеток Pv11 с подавленной экспрессией HSTF после обезвоживания, что также может быть объяснено тем что большинство клеток обезвоженных в условиях сниженной экспрессии HSFT погибали в первый же день регидратации. Также, используя РНК извлеченную из клеток после воздействия siRNA мы провели оценку динамики экспрессии набора из 29 генов, активирующихся на ранних стадиях ангидробиоза (уже на стадии инкубации с трегалозой), сохраняющих высокую экспрессию на всем протяжении ангидробиоза (“ангидробиозные гены”). Для максимальной точности, выбор в оценке экспрессии был сделан в пользу ПЦР в реальном времени в трех независимых биологических повторностях. Изучение экспрессии в клетках инкубирующихся в присутствии трегалозы и подверженных воздействию siРНК, показало что 18 генов из выбранного набора, значительно изменяли экспрессию (t-test, BH adjusted p < 0.05) в клетках с направленной сниженной экспрессией HSFT. Картирование данных CAGE на обновленную сборку генома позволило выявить новые закономерности транскрипционной активности в тканях хирономид в цикле ангидробиоза. Для каждой пары тканей появилась возможность провести анализ обогащенных GO тегов, среди которых 10 являются общими для всех тканей: cell redox homeostasis, protein disulfide oxidoreductase activity, protein-L-isoaspartate (D-aspartate) O-methyltransferase activity, ATPase regulator activity, protein homodimerization activity и другие. Некоторые теги из этой группы соответствуют определенным “Ангидробиотическим генам” – генам напрямую связанным с ангидробиозом - таким как метилтрансферазы PIMT или оксидоредуктазы Trx. Такой результат подчеркивает универсальную роль этих ферментов при переходе к состоянию ангидробиоза. Большая часть “ангидробиозных генов” активировалась при высыхании тканей (75%), при этом ~39% из них проявляли активность в разных тканях схожим образом. С другой стороны, были обнаружены некоторые особенности, связанные с ткане-специфичной активацией этой группы генов: для жирового тела характерны глобины , в кишечнике только один ген тиоредоксина, в мозге это набор из оксидоредуктаз, метилтрансферазы, LEA и др. Среди 31 “ангидробиозного гена”, не повышающих экспрессию в экспериментеприсутствуют стандартные ортологи, либо гены активные в культуре клеток Pv11, но не в тканях, как, например, ген трегалазы. При общем рассмотрении экспрессии “ангидробиозных генов” со всеми остальными активными генами виден общий тренд их активации в экспериментах с обезвоживанием, тогда как все прочие гены в большинстве инактивируются. Кроме того, “ангидробиозные гены” имеют относительно высокую активность и в нормальных условиях. Вместе с достаточно высокой корреляцией между образцами сухих и мокрых тканей мозга и жирового тела, можно предположить, что эти ткани независимо от других частей личинки готовы к переходу в состояние ангидробиоза в любое время (что подкрепляет данные полученные с использованием изолированных нервных тканей личинки). Частичное секвенирование генома и транскриптома хирономиди из других африканских популяций (в Нигерии и Малави) позволил выявить значительную изменчивость в нуклеотидных последовательностях генов, особенно в таковых кодирующих Lea белки. Так, например, мы обнаружили присутствие в геномных последовательностях хирономид из региона Zaria гетерозиготный вариант гена кодирующего белок LEA-5, который нес в себе дополнительную “вставку” кодирующую экстра- канонический повтор из 12 аминокислот, что может быть признаком процесса микроэволюции генов этой группы. В свою очередь, несмотря на успешную идентификацию генов-ортологов в геномах малавийских популяций хирономид, мы обнаружили значительные отличия в первичных последовательностях генов. Так, в среднем на уровне нуклеотидных последовательностей между кодирующими участками нигерийских и малавийских хирономид наблюдалось сходство на уровне 90-95%. В то же время, последовательности кодирующие LEA белки отличались значительность вариабельностью и здесь уровень сходства между ортологами не превышал 85%.В то же время, ген-ортологи LEA отличались схожей динамикой экспрессии, т.е. наиболее представленными транскриптами в обезвоженных личинках как в Малави так и в Нигерии (включая лабораторную линию хирономид), являлись Lea4, Lea1, Lea3, Lea5, Lea7. Полученные данные могут свидетельствовать о значительном влиянии ангидробиоза на процессы радиации в популяциях хирономид. Стоит отметить, что совокупность морфологических и генетических признаков хирономид позволила нам сделать вывод что малавийские популяции можно с достаточной степенью уверенность выделить в отдельный вид.

 

Публикации

1. Биссои А., Кумар А., Ризванов А.А., Несмелов А.А., Гусев О.А., Патра П.К., Бит А. Recent Advances and Future Direction in Lyophilisation and Desiccation of Mesenchymal Stem Cells Stem Cells International, Volume 2016, 2016, Article number 3604203 (год публикации - 2016).

2. Девятияров Р., Лизио М., Гусев О. Application of a CAGE method to an avian development study Methods in Molecular Biology: Avian and Reptilian Developmental biology, Humana Press, - (год публикации - 2017).

3. Девятияров Р.М., Шагимарданова Е.И., Кикавада Т. Regulation of gene expression for L-isoaspartyl O-methyltransferases by cis-elements associated with "heat-shock polytene chromosome puffing formation" in the anhydrobiotic midge BioNanoScience, - (год публикации - 2016).

4. Козлова О.С., Черкасов А.В., Пржиборо А., Шагимарданова Е. Complexity of Expression Control of HSP70 Genes in Extremophilic Midges BioNanoScience, December 2016, Volume 6, Issue 4, pp 388–391 (год публикации - 2016).

5. Рябова А.В., Мукае К., Черкассов А.В., Корнетт Р., Шагимарданова Е.И., Сакашита Т., Окуда Т., Кикавада Т., Гусев О.А. Genetic background of enhanced radioresistance in an anhydrobiotic insect: transcriptional response to ionizing radiations and desiccation Extremophiles, - (год публикации - 2016).

6. Согаме Й., Окада Д., Кикута С., Мията Й., Корнетт Р., Гусев О.А., Кикавада Т. Establishment of gene transfer and gene silencing methods in a desiccation-tolerant cell line, Pv11 Extremophiles, - (год публикации - 2016).

7. Читани M., Моримото Х., Такеяма K., Мантоку A., Танигава Н., Кубота. М., Сузуки Х., Учида С, Танигаки Ф., Ширакава М., Гусев О., Сычев В., Такано М., Ито T., Кудо А. Acute transcriptional up-regulation specific to osteoblasts/osteoclasts in medaka fish immediately after exposure to microgravity Scientific Reports, - (год публикации - 2017).