Аннотация результатов, полученных в 2014 году
Неспособность природных материалов полностью воспроизводить сложную структуру межклеточного матрикса привела к необходимости создания децеллюляризированных естественных межклеточных матриксов, полученных от доноров, либо каркасов, изготовленных из полимерных материалов и полностью воспроизводящих структуру нативного органа. На первом этапе проекта, выполняемого в 2014 году, были проведены необходимые исследования, направленные на получение естественного донорского каркаса пищевода низших приматов. Основываясь на имеющемся опыте создания тканеинженерной конструкции пищевода на модели мелких лабораторных животных (крысы), была проведена аналитическая и практическая работа для трансляции данной технологии на модель крупных лабораторных животных (низшие приматы). Был разработан протокол децеллюляризации (обесклечивания) пищевода для модели низших приматов. Нативный орган – изолированный пищевод низших приматов - был подвергнут процедуре децеллюляризации, и получены образцы децеллюляризованных органов. После получения децеллюляризированного матрикса была проведена его качественная оценка: сохранности, биомеханических характеристик и отсутствия антигенности. Для этого применялись следующие методы: a) Микроскопическая и ультраструктурная оценка ткани –H&E, SEM b) Сохранность белков внеклеточного матрикса: важные биоактивные белки – коллаген I, коллаген III, коллаген IV, эластин, фибронектин, ламинин, VEGF - определялись количественно и качественно. с) Механические свойства: стресс-тест (орган был подвергнут постоянному раздуванию/уплощению для адаптации к физиологическому давлению при глотании), давление разрыва (орган был раздут до предела с регистрацией кривых «давление-объем»), оценка продольных механических свойств окончательно получена в испытаниях на растяжение. Результаты проведенных тестов показали, что полученный каркас может служить потенциальной основой для создания тканеинженерного органа без риска отторжения. Была проведена подготовительная работа для последующей рецеллюляризации (засеивания) каркаса клетками - получение наиболее подходящих типов клеток для засеивания каркаса, в частности МСК. На основании методики получения МСК из костного мозга крысы был разработан протокол получения МСК из образцов костного мозга приматов. Результаты, полученные в короткий период - в течение трех месяцев 2014 года, дают основания для продолжения работы по созданию полноценного тканеинженерного органа для модели низших приматов с последующей его трансплантацией.

Аннотация результатов, полученных в 2015 году
Основной проблемой при создании тканеинженерной конструкции для любого органа является получение идеального каркаса, который должен отвечать следующим требованиям: биосовместимость (способность материала встраиваться в организм, не вызывать побочных явлений и индуцировать клеточный или тканевой ответ, необходимый для достижения оптимального терапевтического эффекта), биоразлагаемость (в последующем клеточный каркас должен быть заменен собственной тканью). Также он должен имитировать механические свойства органа, и иметь пористую структуру - для обеспечения тканевой интеграции, васкуляризации и иннервации. Для достижения этих целей в 2015 г. научной группой были отработаны 2 протокола получения биологического каркаса методом децеллюляризации (обесклечивания) пищевода низших приматов (Macaca mulatta), и получены децеллюляризованные образцы. Проведенные тесты для оценки вышеперечесленных свойств дают основание утверждать, что полученные каркасы могут стать основой создания нового органа. Далее группой были отработаны протоколы выделения и культивирования мультипотентных мезенхимальных стромальных стволовых клеток (ММСК) низших приматов (Macaca mulatta) и разработаны протоколы статичной рецеллюляризации (засеивания) каркасов пищевода. Проведена рецеллюляризация полученных децеллюляризированных матриксов с определением их токсичности, жизнеспособности клеток, их адгезии. Получены рецеллюляризированные образцы пищевода - прототипы органов, созданных методом тканевой инженерии. В отчетном году группа начала исследования полученных образцов in vivo. Были проведены гетеротопические трансплантации нативного, децеллюляризированного и рецеллюляризированного (с использованием GFP-позитивных ММСК крысы) пищевода низших приматов крысам (ксеногенная модель), и затем - ортотопические трансплантации децеллюляризированного матрикса пищевода низших приматов крысам (ксеногенная модель). В 2016 году планируется продолжить трансплантации для проверки жизнеспособности тканеинженерного пищевода на модели низших приматов.

Аннотация результатов, полученных в 2016 году
Тканевая инженерия пищевода во многом зависит от донорства органов, и процесс извлечения органов и их децеллюляризация по своей сути сложны и критичны по времени. Биосинтетические материалы представляют собой альтернативу биологическим каркасам, поскольку могут быть изготовлены с учетом потребностей пациентов. Некоторые эксперименты in vitro на полимерах, полученных методом электроспининга, in vivo эксперименты с другими материалами, и одно исследование клинического случая с использованием биоисинтетического внеклеточного матрикса показывают, что такой подход может быть успешным и в тканевой инженерии пищевода. Несмотря на это, крупные - и особенно трубчатые трансплантаты характеризовались малым ростом или полным отсутствием роста мышц, вызывая серьезные осложнения. Таким образом, мы поставили задачу найти материал и метод, который может позволить полому трубчатому трансплантату быть действительно успешным в клинических условиях. Наши соисполнители из Курчатовского института в Москве получили первую версию синтетического каркаса пищевода методом электроспининга с диапазоном диаметра волокна 1.6-3.6 мкм, плотностью, 7,1%, толщиной 0,77 мм из полиамида-6, который мы рассматривали в качестве подходящего субстрата для создания каркаса при тканевой инженерии пищевода. Этот полимерный материал показал наилучшую in vitro биосовместимость при оценке вслепую. Учитывая успешные результаты тестирования in vitro, следующим этапом было тестирование биосовместимости и биомеханических свойств полиамида-6 in vivo. Обычно первые тесты in vivo проводятся на небольших животных, таких как грызуны. К сожалению, наш предыдущий опыт показал, что, трансплантация пищевода у таких мелких животных является весьма сложной , хотя и возможной, хирургической задачей, и может иметь очень сложные послеоперационные последствия. Кроме того, было отмечено, что животные модели, которые сильно отличаются от людей по биомеханике, иммунологически и генетически, дают мало информации о возможном успехе биоматериала и метода при переводе в клинику. Поэтому мы решили использовать бабуинов Papio Hamadryas в качестве модели in vivo в данном исследовании, представляющих более близкую клиническую модель. Впервые в мировой практике были выполнены 10 ортотопических трансплантаций участка тканеинженерного пищевода (2D скаффорлд) низшим приматам (август 2016), срок послеоперационного наблюдения за животными на момент подачи итогового отчета составляет 4 месяца. Животные чувствуют себя нормально. Промежуточные исследования проведены спустя 3 месяца после трансплантации, итоговые планируются спустя шесть месяцев - в феврале 2017 г. Все 10 животных успешно перенесли трансплантацию, ни у одного в течение 4 месяцев не наблюдалось симптомов, требующих немедленного вмешательства ветеринара, ни одно животное не было в состоянии, требующем выведения из эксперимента. Ни у одного животного не было отмечено симптомов психологической нестабильности, которые свидетельствовали бы о боли или стрессе, а также – симптомов местного воспалительного процесса или инфекции, требующих вмешательства. Все 10 животных могли свободно глотать в течение всего периода наблюдений. В процессе выполнения этого эксперимента получены уникальные данные и созданы протоколы, касающиеся использования модели низших приматов в тканевой инженерии и регенеративной медицине, в том числе, - операционного и послеоперационного ведения, наблюдения за животными и проведения специальных манипуляций для оценки результатов (эндоскопия, биопсия и пр.). Протокол трансплантации тканеинженерной конструкции пищевода низшим приматам, созданный в процессе данного исследования, является наиболее приближенным к возможному клиническому протоколу.