КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер14-45-00018

НазваниеСоздание тканеинженерной конструкции пищевода для замены поврежденного органа на модели низших приматов

РуководительМаккиарини Паоло , Доктор медицинских наук

Организация финансирования, регионфедеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Казанский (Приволжский) федеральный университет", Республика Татарстан

Года выполнения2014 - 2016

КонкурсКонкурс 2014 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований международными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины, 05-405 - Регенеративная медицина

Ключевые словаРегенеративная медицина, тканевая инженерия, децеллюляризация, рецеллюляризация, каркас, трансплантация, регенерация, биореактор, стволовые клетки, пищевод

Код ГРНТИ34.03.37


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
Данный проект направлен на решение фундаментальной проблемы медицины, связанной с изучением механизмов регенерации тканей и созданием функционирующих тканеинженерных конструкций, способных заменить поврежденные органы. В течение более полувека решением этой проблемы было осуществление трансплантаций органов от доноров. Однако, нехватка донорских органов, сложность их доставки, трудность подбора иммунологически совместимых органов и пожизненное назначение иммуносупрессивной терапии привели к развитию современной тканевой инженерии, приоритетным направлением которой является разработка биоинженерных каркасов с последующим заселением их аутологичными клетками. Цель проекта - создание функционирующей тканеинженерной конструкции пищевода для полноценной замены поврежденного органа, без привлечения иммуносупрессивной терапии и исследование ее свойств in vitro и in vivo на модели низших приматов, что откроет реальные возможности для последующего клинического применениния. В настоящее время осуществляются попытки поиска способов создания тканеинженерного пищевода, способного заменить поврежденный орган. Однако, эти попытки пока не привели к созданию конструкций, воспроизводящих структуру и функции нативного органа, кроме того исследования проводились на модели мелких лабораторных животных, и это ограничивает перспективы применения в клинике. Ежегодно у более чем 500 000 пациентов диагностируется рак пищевода, при котором требуется хирургическое вмешательство с резекцией не менее одной трети данного органа. В настоящий момент хирургическое лечение этих больных, а также - пациентов с различными повреждениями пищевода и врожденными дефектами заключается в проведении крайне травматичных оперативных вмешательств, связанных с высокой смертностью пациентов, и даже в случае положительного исхода – значительным процентом инвалидизации.Тканевая инженерия, которая позволяет создать биологическую конструкцию для замены поврежденного или удаленного органа в лабораторных условиях, обладает огромным потенциалом спасения жизни и улучшения качества жизни таких больных. За последние три года наша группа добилась существенных результатов на пути создания тканеинженерного пищевода у крыс, которые мы предполагаем использовать и развить на модели низших приматов. Подобная задача будет решена впервые в мире. Для решения этой задачи нами будет использована комбинация основных составляющих тканевой инженерии: 3D структура-каркас, воспроизводящая архитектонику и биомеханические свойства данного органа, клетки – в данном случае, аутологичные или аллогенные мультипотентные мезенхимальные стволовые клетки (ММСК), которыми будет засеян каркас, и биореактор, воспроизводящий физиологические условия организма. Более детально наши исследования будут сфокусированы на следующих задачах: оценка механических и биомеханических свойств нативного пищевода; разработка протокола децеллюляризации нативного пищевода для создания каркаса, сохраняющего компоненты внеклеточного матрикса, чтобы обеспечить сходные с нативной тканью структурные, биомеханические свойства, отсутствие риска отторжения при последующей имплантации; рецеллюляризация (засеивание) каркаса ММСК; проведение гетеротопических и ортотопических трансплантаций на приматах. Также будет проведен скрининг и отбор различных искусственных материалов на предмет наилучшего взаимодействия с клетками и их дифференцировки в послойную структуру ткани натурального пищевода, что послужит основой для создания искусственного каркаса в будущем. Децеллюляризированные каркасы биологически активны и имеют в своем составе белки, стимулирующие рост сосудов, активность стволовых клеток и т.д. Искусственные каркасы лишены этой способности, но обладают другими очень важными преимуществами: не требуют наличия донорских органов, могут быть созданы в точном соответствии с размерами органа реципиента, прочны. Данный проект предполагает изучение и сравнение свойств нативного и децеллюляризованного пищевода, что даст возможность использовать полученные данные в дальнейшем для создания искусственных тканеинженерных каркасов. Предлагаемый проект относится к регенеративной медицине, и новые знания о механизмах регенерации тканей, полученные в процессе его выполнения, могут быть использованы для создания других тканеинженерных конструкций, замещающих различные поврежденные органы и ткани, а также - в клеточной биологии, трансплантологии.

Ожидаемые результаты
Главным результатом представляемого проекта станет создание тканеинженерной конструкции пищевода и ее оценка in vitro и in vivo на модели низших приматов. Тканевая инженерия в данном случае обеспечивает совершенно новую концепцию для регенерации тканей и трансплантации органов и представляет собой новейший подход для решения задачи замены поврежденного пищевода и ликвидации дефектов этого органа у взрослых и детей. Проект предполагает получение новых знаний о молекулярных механизмах регенерации и воспроизведение этих механизмов на модели низших приматов. Также, для разработки подходов к созданию искусственного каркаса тканеинженерного пищевода будут исследованы различные биополимерные материалы на предмет сохранения жизнеспособности прикрепляемых клеток, дифференцировки клеток – для максимального воссоздания структуры и функций естественного органа. Трансплантация тканеинженерной конструкции пищевода, на создание которой направлен проект, может в будущем спасти жизнь и обеспечить ее высокое качество большому числу больных с приобретенными и врожденными заболеваниями пищевода, включая протяженный стеноз, атрезию пищевода, трахео-пищеводные фистулы, ожоги, рак. Для пациента созданный тканеинженерный орган станет единственным шансом на выживание в сложных случаях, когда невозможно использование донорского органа, либо заменит трансплантацию донорского органа, избавив его от применения иммуносупрессивных препаратов. Наши предыдущие исследования на модели мелких млекопитающих показали многообещающие результаты, и их развитие на модели приматов сделает трансплантацию тканеинженерного пищевода в клинике реальной уже в ближайшие годы. Проект будет выполнен силами учреждений высочайшего класса - Международного научно-исследовательского клинико-образовательного центра регенеративной медицины Кубанского государственного медицинского университета (Россия) и Центра регенеративной медицины ACTREM Каролинского института (Швеция) при участии Лаборатории полимерных материалов НИЦ «Курчатовский Институт» и НИИ медицинской приматологии, что обеспечит высокий мировой уровень исследований и полученных результатов.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация полученных результатов в 2014 году
Неспособность природных материалов полностью воспроизводить сложную структуру межклеточного матрикса привела к необходимости создания децеллюляризированных естественных межклеточных матриксов, полученных от доноров, либо каркасов, изготовленных из полимерных материалов и полностью воспроизводящих структуру нативного органа. На первом этапе проекта, выполняемого в 2014 году, были проведены необходимые исследования, направленные на получение естественного донорского каркаса пищевода низших приматов. Основываясь на имеющемся опыте создания тканеинженерной конструкции пищевода на модели мелких лабораторных животных (крысы), была проведена аналитическая и практическая работа для трансляции данной технологии на модель крупных лабораторных животных (низшие приматы). Был разработан протокол децеллюляризации (обесклечивания) пищевода для модели низших приматов. Нативный орган – изолированный пищевод низших приматов - был подвергнут процедуре децеллюляризации, и получены образцы децеллюляризованных органов. После получения децеллюляризированного матрикса была проведена его качественная оценка: сохранности, биомеханических характеристик и отсутствия антигенности. Для этого применялись следующие методы: a) Микроскопическая и ультраструктурная оценка ткани –H&E, SEM b) Сохранность белков внеклеточного матрикса: важные биоактивные белки – коллаген I, коллаген III, коллаген IV, эластин, фибронектин, ламинин, VEGF - определялись количественно и качественно. с) Механические свойства: стресс-тест (орган был подвергнут постоянному раздуванию/уплощению для адаптации к физиологическому давлению при глотании), давление разрыва (орган был раздут до предела с регистрацией кривых «давление-объем»), оценка продольных механических свойств окончательно получена в испытаниях на растяжение. Результаты проведенных тестов показали, что полученный каркас может служить потенциальной основой для создания тканеинженерного органа без риска отторжения. Была проведена подготовительная работа для последующей рецеллюляризации (засеивания) каркаса клетками - получение наиболее подходящих типов клеток для засеивания каркаса, в частности МСК. На основании методики получения МСК из костного мозга крысы был разработан протокол получения МСК из образцов костного мозга приматов. Результаты, полученные в короткий период - в течение трех месяцев 2014 года, дают основания для продолжения работы по созданию полноценного тканеинженерного органа для модели низших приматов с последующей его трансплантацией.

 

Публикации

1. Губарева Е..А., Сьоквист C., Сотниченко А.С., Лим М. Л., Фелиу-Торрес Н., Даниленко К.А., Орлов С.В., Чвалун С.Н., Григорьев Т.Е., Крашенинников С.Н., Порханов В.А., Поляков И.С., Куевда Е.В., Гуменюк И.С., Маккиарини П. "Децеллюляризация пищевода низших приматов" «Гены и Клетки» (старое название «Клеточная Трансплантология и Тканевая Инженерия»), - (год публикации - 2014).


Аннотация полученных результатов в 2015 году
Основной проблемой при создании тканеинженерной конструкции для любого органа является получение идеального каркаса, который должен отвечать следующим требованиям: биосовместимость (способность материала встраиваться в организм, не вызывать побочных явлений и индуцировать клеточный или тканевой ответ, необходимый для достижения оптимального терапевтического эффекта), биоразлагаемость (в последующем клеточный каркас должен быть заменен собственной тканью). Также он должен имитировать механические свойства органа, и иметь пористую структуру - для обеспечения тканевой интеграции, васкуляризации и иннервации. Для достижения этих целей в 2015 г. научной группой были отработаны 2 протокола получения биологического каркаса методом децеллюляризации (обесклечивания) пищевода низших приматов (Macaca mulatta), и получены децеллюляризованные образцы. Проведенные тесты для оценки вышеперечесленных свойств дают основание утверждать, что полученные каркасы могут стать основой создания нового органа. Далее группой были отработаны протоколы выделения и культивирования мультипотентных мезенхимальных стромальных стволовых клеток (ММСК) низших приматов (Macaca mulatta) и разработаны протоколы статичной рецеллюляризации (засеивания) каркасов пищевода. Проведена рецеллюляризация полученных децеллюляризированных матриксов с определением их токсичности, жизнеспособности клеток, их адгезии. Получены рецеллюляризированные образцы пищевода - прототипы органов, созданных методом тканевой инженерии. В отчетном году группа начала исследования полученных образцов in vivo. Были проведены гетеротопические трансплантации нативного, децеллюляризированного и рецеллюляризированного (с использованием GFP-позитивных ММСК крысы) пищевода низших приматов крысам (ксеногенная модель), и затем - ортотопические трансплантации децеллюляризированного матрикса пищевода низших приматов крысам (ксеногенная модель). В 2016 году планируется продолжить трансплантации для проверки жизнеспособности тканеинженерного пищевода на модели низших приматов.

 

Публикации

1. Губарева Е.А., Сотниченко А.С., Куевда Е.В.,Сьоквист С., Феллиу Торрес Н., Орлов С.В., Гилевич И.В., Гуменюк И.С., Порханов В.А., Маккиарини П. Иммуноморфологическая характеристика децеллюляризованного пищевода низшего примата Журнал "Современные проблемы науки и образования", 2015. – № 2 (год публикации - 2015).

2. E. Gubareva, E. Kuevda, A. Sotnichenko, I. Gilevich, I. Gumenyuk, K. Danilenko, S. Sjöqvist, M. L. Lim, T. Grigoriev, S. Krasheninnikov, S. Chvalun, T. Sharkova, D. Karal-ogly, S. Orlov, P. Macchiarini Esophagus decellularization in nonhuman primates Regenerative Medicine, ISSN: 1746-0751, Volume 10 (год публикации - 2015).

3. Губарева Е.А., Куевда Е.В., Сотниченко А.С., Сьеквист С., Гуменюк И.С., Мей Линг Лим, Карал-оглы Д. Д., Фелиу Неус Торрес, Маркушин В.А., Порханов В.А., Маккиарини П. "Выделение и характеристика ММСК макак-резус для рецеллюляризации тканеинженерного пищевода" Журнал "Гены и клетки", т.10 №3/4 2015 (год публикации - 2015).

4. Е.А.Губарева, А.А.Басов, Е.В.Куевда, А.С.Сотниченко, С.С.Джимак, К.А.Даниленко, И.С.Гуменюк, В.А.Маркушин, В.А.Порханов, С.В.Орлов, П. Маккиарини "Перспективы использования ЭПР-спектроскопии для оценки свободнорадикальных процессов при создании тканеинженерных конструкций пищевода и диафрагмы" Журнал "Гены и клетки", т.10 №3/4 2015 (год публикации - 2015).


Аннотация полученных результатов в 2016 году
Тканевая инженерия пищевода во многом зависит от донорства органов, и процесс извлечения органов и их децеллюляризация по своей сути сложны и критичны по времени. Биосинтетические материалы представляют собой альтернативу биологическим каркасам, поскольку могут быть изготовлены с учетом потребностей пациентов. Некоторые эксперименты in vitro на полимерах, полученных методом электроспининга, in vivo эксперименты с другими материалами, и одно исследование клинического случая с использованием биоисинтетического внеклеточного матрикса показывают, что такой подход может быть успешным и в тканевой инженерии пищевода. Несмотря на это, крупные - и особенно трубчатые трансплантаты характеризовались малым ростом или полным отсутствием роста мышц, вызывая серьезные осложнения. Таким образом, мы поставили задачу найти материал и метод, который может позволить полому трубчатому трансплантату быть действительно успешным в клинических условиях. Наши соисполнители из Курчатовского института в Москве получили первую версию синтетического каркаса пищевода методом электроспининга с диапазоном диаметра волокна 1.6-3.6 мкм, плотностью, 7,1%, толщиной 0,77 мм из полиамида-6, который мы рассматривали в качестве подходящего субстрата для создания каркаса при тканевой инженерии пищевода. Этот полимерный материал показал наилучшую in vitro биосовместимость при оценке вслепую. Учитывая успешные результаты тестирования in vitro, следующим этапом было тестирование биосовместимости и биомеханических свойств полиамида-6 in vivo. Обычно первые тесты in vivo проводятся на небольших животных, таких как грызуны. К сожалению, наш предыдущий опыт показал, что, трансплантация пищевода у таких мелких животных является весьма сложной , хотя и возможной, хирургической задачей, и может иметь очень сложные послеоперационные последствия. Кроме того, было отмечено, что животные модели, которые сильно отличаются от людей по биомеханике, иммунологически и генетически, дают мало информации о возможном успехе биоматериала и метода при переводе в клинику. Поэтому мы решили использовать бабуинов Papio Hamadryas в качестве модели in vivo в данном исследовании, представляющих более близкую клиническую модель. Впервые в мировой практике были выполнены 10 ортотопических трансплантаций участка тканеинженерного пищевода (2D скаффорлд) низшим приматам (август 2016), срок послеоперационного наблюдения за животными на момент подачи итогового отчета составляет 4 месяца. Животные чувствуют себя нормально. Промежуточные исследования проведены спустя 3 месяца после трансплантации, итоговые планируются спустя шесть месяцев - в феврале 2017 г. Все 10 животных успешно перенесли трансплантацию, ни у одного в течение 4 месяцев не наблюдалось симптомов, требующих немедленного вмешательства ветеринара, ни одно животное не было в состоянии, требующем выведения из эксперимента. Ни у одного животного не было отмечено симптомов психологической нестабильности, которые свидетельствовали бы о боли или стрессе, а также – симптомов местного воспалительного процесса или инфекции, требующих вмешательства. Все 10 животных могли свободно глотать в течение всего периода наблюдений. В процессе выполнения этого эксперимента получены уникальные данные и созданы протоколы, касающиеся использования модели низших приматов в тканевой инженерии и регенеративной медицине, в том числе, - операционного и послеоперационного ведения, наблюдения за животными и проведения специальных манипуляций для оценки результатов (эндоскопия, биопсия и пр.). Протокол трансплантации тканеинженерной конструкции пищевода низшим приматам, созданный в процессе данного исследования, является наиболее приближенным к возможному клиническому протоколу.

 

Публикации

1. Мавликеев М.О., Архипова С.С., Тенчурин Т.К., Шепелев А.Д.,Чвалун С.Н., Маккиарини П. In vitro cytotoxicity of electrospun scaffolds for aerodigestive tissue engineering Human Gene Therapy, Т. 27. № S. P. A72 (год публикации - 2016).

2. Байгуэра С., Архипова С., Денгпинг И., Холтерман М., Маккиарини П. Rat Bile Duct Decellularization BioNanoScience, Volume 6 Number 4 (год публикации - 2016).

3. Сотниченко А. С., Губарева Е. А., Куевда Е. В., Гуменюк И. С., Гилевич И. В.,Орлов С. В. , Маккиарини П. СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ПРОТОКОЛОВ ДЕЦЕЛЛЮЛЯРИЗАЦИИ ПИЩЕВОДА НА МОДЕЛИ MACACA M МЕДИЦИНСКИЙ ВЕСТНИК СЕВЕРНОГО КАВКАЗА, 2016. Vоl. 11. Iss. 2 (год публикации - 2016).

4. Гилазиева З. Е., Архипова С.С., Журавлева М. Н., Маккиарини П. ОРГАНОИДЫ ПИЩЕВОДА: ВОЗМОЖНОСТИ СОЗДАНИЯ И ПОТЕНЦИАЛ ДЛЯ ТКАНЕВОЙ ИНЖЕНЕРИИ Genes&Cells (Гены и клетки), - (год публикации - 2017).