КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 17-75-20199

НазваниеВлияние Тат белка вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) на дифференцировку В-клеток и развитие В-клеточных лимфом у ВИЧ-инфицированных пациентов.

РуководительМусинова Яна Рафаеловна, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, г Москва

Период выполнения при поддержке РНФ 07.2017 - 06.2020 

Конкурс№24 - Конкурс 2017 года по мероприятию «Проведение исследований научными группами под руководством молодых ученых» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными.

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины, 05-401 - Молекулярная и клеточная медицина

Ключевые словаВирус иммунодефицита человека, СПИД, онкогенез, лимфома, экспрессия генов, некодирующие РНК

Код ГРНТИ34.15.31


СтатусУспешно завершен


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
В последние годы достигнут заметный прогресс в изучении вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), что, в результате, позволило разработать и внедрить лекарственные препараты, сдерживающие развитие болезни. После внедрения высокоэффективной антиретровирусной терапии (HAART) лимфомы стали одной из основных причин смертности среди ВИЧ-инфицированных пациентов (Bibas & Antinori 2009; Han et al. 2016). Большинство лимфом у ВИЧ-инфицированных пациентов имеет В-клеточное происхождение, хотя В-клетки не инфицируются ВИЧ. Причем, у ВИЧ-инфицированных пациентов повышается вероятность развития только некоторых типов лимфом, например, лимфомы Беркитта. Лимфома Беркитта редко встречается в Европе и США, но она широко распространена среди африканских детей, у которых развитие этой лимфомы связано с инфекцией вируса Эпштейна-Барр. В европейских странах и Северной Америке лимфома Беркитта с высокой частотой встречаются только у пациентов, инфицированных ВИЧ (Clifford et al. 2005; Engels et al. 2008). ВИЧ продуцирует небольшой (14 kDa) белок-активатор транскрипции Tat (trans-activator of transcription), который активирует транскрипцию вирусных генов (Van Lint et al. 2013) и модулирует различные клеточные процессы, взаимодействуя с компонентами ядра (Romani et al. 2010). Tat способен выделяться из инфицированных клеток, и значительные концентрации этого вирусного белка детектируются в плазме ВИЧ-инфицированных пациентов (Westendorp et al. 1995), даже проходящих антиретровирусную терапию (Mediouni et al. 2012)(Germini et al., 2017). Tat может проникать в окружающие неинфицированные клетки, в том числе, в В-лимфоциты (см. обзор: Musinova et al. 2016). В результате, хотя ВИЧ и не инфицирует В-клетки, в них проникает Tat белок (Frankel & Pabo 1988; см. обзор: Musinova et al. 2016) что, как показано на трансгенных мышах экспрессирующих Тат, может приводить к развитию В-клеточных лимфом (Kundu et al. 1999). Таким образом, Tat белок является наиболее вероятным кандидатом на роль фактора, приводящего к развитию В-клеточных лимфом у ВИЧ инфицированных пациентов. Белок Тат является транскрипционным фактором, способным связываться с хроматином как напрямую (Marban, 2011, Reeder, 2016), так и взаимодействуя в ядерными белками, например, с белковыми комплексами, вовлеченными в модификации хроматина (гистоновые ацетилтрансферазы, CBP/p300 комплекс, SWI/SNF хроматин-ремоделирующий комплекс и т.д. (см. обзор Musinova et al. 2016). Эти данные получены на Т-клетках, а данные о влиянии Тат на В-клетки в литературе практически отсутствуют. Мы предполагаем, что взаимодействие Tat белка с компонентами клеточного ядра приводит к изменению экспрессии генов В-клеток, что может вызывать изменения в процессе клеточной дифференцировки, а также являться первым онкогенеза у ВИЧ-инфицированных пациентов. Проект предусматривает работы по трем основным направлениям - разработка новой модели для экспрессии Tat белка в лимфобластоидных клетках RPMI 8866, анализ изменений в профилях экспрессии кодирующих и некодирующих последовательностей в случаях стабильной и индуцибельной экспрессии Tat белка и анализ мутагенного действия Tat белка. Действие Tat белка на В-лимфоциты изучено крайне слабо и полученные в ходе реализации проекта данные не имеют прямых аналогов в литературе. Выяснение основных событий, вызываемых Tat белком в В-лимфоцитах может стать основой для поиска способов предотвращения онкогенеза и поиска таргетных препаратов для лечения развившихся лимфом. Таким образом, изучение специфических механизмов онкогенеза и В-клеточного иммунитета, вызываемого у ВИЧ-инфицированных пациентов Tat белком, является актуальной темой, имеющей важное значение для фундаментальной медицины.

Ожидаемые результаты
В результате выполнения проекта будут получены следующие результаты: 1. Будут выявлено и охарактеризовано влияние белка Тат ВИЧ на экспрессию кодирующих (mRNA) и некодирущих (ncRNA) РНК в линии В-клеток человека RPMI 8866 в условиях его постоянной экспрессии в клетках. 2. Будет разработана система индуцибельной экспрессии Tat белка в клетках RPMI 8866 3. Будет проведен сравнительный анализ краткосрочных и длительных эффектов Tat белка на линии В-клеток человека 4. Будет изучено влияние Tat белка на стабильность генома В-клеток и на частоту хромосомных перестроек в этих клетках под влиянием белка Тат. В результате реализации проекта будут получены результаты мирового уровня, которые будут опубликованы в ведущих международных и отечественных журналах, а также представлены на ведущих конференциях. Результаты исследования могут послужить основой для разработки методов предотвращения развития лимфом у ВИЧ-инфицированных пациентов, а также для поиска новых мишеней для таргетной терапии В-клеточных лимфом у ВИЧ-инфицированных пациентов.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Первый этап выполнения проекта был посвящен (1) работе по характеристике эффекта Tat белка на культивируемые лимфоциты RPMI 8866 с использованием полученных нами ранее клеточных линий, (2) а также подготовке к получению новых линий с индуцибельной экспрессией Tat белка. В отчетном периоде были проведены следующие работы (1) В ходе выполнения проекта был начат RNA-seq анализ изменений экспрессии кодирующих и некодирующих последовательностей под действием Tat белка. В соответствии с планом работ было проведено секвенирование и предварительный биоинформатический анализ кодирующих последовательностей. Анализ некодирующих последовательностей запланирован на второй этап. Поставлен эксперимент по цитогенетическому анализу культур, с целью оценки влияния Tat белка на стабильность генома. Предварительные результаты показывают, что Tat белок обладает мутагенным эффектом. Окончательный анализ и повтор эксперимента также запланированы на второй этап выполнения проекта. (2) Клонированы все необходимые плазмиды и отработан протокол электропорации для получения клеточных линий для индуцибельной экспрессии Tat белка. По итогам работы опубликована одна обзорная статья в журнале "Биохимия", результаты представлены на конференции "Клеточная биология: проблемы и перспективы", тезисы которой опубликованы в журнале "Цитология".

 

Публикации

1. Арифулин Е.А., Мусинова Я.Р., Васецкий Е.С., Шеваль Е.В. Подвижность компонентов клеточного ядра и функционирование геноме Биохимия, том 83, вып. 6, с. 870 – 882 (год публикации - 2018)

2. Курнаева М.А., Шубина М.Ю., Мусинова Я.Р. Сравнительный анализ механизмов действия сигналов ядерной и ядрышковой локализации. Цитология, Цитология. 59 (11) : 771 (год публикации - 2017)


Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В ходе выполнения второго этапа проекта (2018-2019 г.г.) были завершены работы по двум направлениям - характеристика влияния Tat белка на экспрессию генов в культивируемых B-лимфоцитах и влияние Tat белка на стабильность генома. Параллельно начаты работы по изучению компенсаторных реакций клетки на появление Tat белка. 1. Проведен биоинформационный анализ данных, полученных в 2017-2018 году. Проведен анализ дифференциально экспрессируемых генов в клетках RPMI 8866. Выявлены сигнальные пути, измененные в клетках с экспрессией Tat белка. Полученные данные свидетельствуют, что происходит одновременная активация путей, которые, по-видимому, активируются вирусным белком, и путей, которые препятствуют развитию вирусной инфекции (компенсаторные реакции клетки). Проведен также анализ экспрессии длинных некодирующих РНК. Было выявлено 145 длинных некодирующих РНК, аннотированных в LNCipedia. Дифференциально экспрессируемые lncRNAs составляют примерно 25% от всех дифференциально экспрессируемых генов, что косвенно свидетельствует о важности этих изменений. Среди выявленных РНК особое значение могут иметь MALAT1 и NEAT1 РНК. Также проведено сравнение полученных данных с данными анализа транкриптома в Т-лимфоцитах, экспрессирующих Tat белок (Reeder et al., 2015; doi: 10.7554/eLife.08955). Перекрытия в списках дифференциально экспрессируемых генов между опубликованными данными и нашими данными крайне невелики. Вероятно, это может быть свидетельством того, что Tat белок действует специфично на разные типы клеток. 2. Завершены эксперименты по изучению стабильности кариотипа в клетках, экспрессирующих Tat-EGFP. Метафазные хромосомы были проанализированы на предмет появления транслокаций, дицентриков, ацентриков и делеций, также учитывались случаи полиплоидиии и анеуплоидии. В обеих повторностях мы наблюдали достоверное увеличение количество транслокаций и общего числа структурных аберраций в клетках, которые экспрессировали Tаt-EGFP. Таким образом, данные работы подтверждают предположение о том, что Tat белок приводит к структурным аберрациях хромосом. 3. Получены и охарактеризованы клеточные линии для стабильной и индуцибельной экспрессии Tat белка в клетках RPMI 8866. Для изучения действия Tat белка на В-клетки получены и охарактеризованы новые клеточные линии на основе культивируемых В-клеток линии RPMI 8866 с постоянной и индуцибельной экспрессией Tat белка. Особенностью данных линий является то, что Tat белок не был слит ни с каким тагом. Для полученных линий подтверждена экспрессия Tat белка, а также его трансактиваторная активность. Проведено изучение изменений в экспрессии генов (RNA-seq) для полученных культур. 4. В ходе этапа 2018-2019 г.г. были подготовлены к печати две работы по Tat белку - обзор в "Reviews of Medical Virology" (IF 5.034) и экспериментальная статья в "Онтогенезе" (IF 0.519). Результаты реализации проекта представлялись на XVIII Всероссийском симпозиуме «Структура и функции клеточного ядра».

 

Публикации

1. Горбачева М.А.,Тихомирова М.А., Поташникова Д.М., Акбай Б., Шеваль Е.В., Мусинова Я.Р. Создание стабильных клеточных линий на основе культивируемых в-клеток RPMI 8866 с постоянной и индуцибельной экспрессией Tat белка вируса иммунодефицита человека Онтогенез, - (год публикации - 2019)

2. Курнаева М.А., Шеваль Е.В,, Мусинова Я.Р., Васетский Е.С. Tat basic domain: A "Swiss army knife" of HIV-1 Tat? Reviews in Medical Virology, 29(2):e2031 (год публикации - 2019) https://doi.org/10.1002/rmv.2031

3. Курнаева М.А.,. Арифулин Е.А., Мусинова Я.Р., Васецкий Е.С., Шеваль Е.В. Механизмы накопления в ядре tat белка вируса иммунодефицита человека (HIV-1). Издательство Политехнического университета, Санкт-Петербург, стр 36. (год публикации - 2018)


Аннотация результатов, полученных в 2019 году
На этапе 2019-2020 года были завершены работы по анализа влияния Tat белка вируса иммунодефицита человека на культивируемые В-лимфоциты линии RPMI 8866. (1) Проведено сравнение влияния стабильной и индуцибельной экспрессии Tat белка на культивируемые В-клетки линии RPMI 8866, что позволило выявить прямые эффекты Tat белка и компенсаторные реакции клетки на появление Tat белка. (2) Проведены работы по изучению возможного влияния транскрипционных факторов PBX1, FOXO3, STAT1 и RUNX1 на экспрессии генов в клетках с экспрессией Tat белка. (3) В ходе подготовки публикаций проведен анализ литературы и сравнение данных, полученных в результате выполнения проекта на разных культурах (как предоставленных нам ранее соавторами, так и полученных в ходе выполнения проекта), и данных, имеющихся в литературе. (4) Подготовлены итоговых публикации по результатам выполнения всего проекта.

 

Публикации

1. Харитонов А.В., Шубина М.Ю., Мамонтова А.В., Арифулин Е.А., Лисицына О.М,, Налобин Д.С,, Мусинова Я.Р,, Шеваль Е.В. Switching of cardiac troponin I between nuclear and cytoplasmic localization during muscle differentiation Biochimica et Biophysica Acta (BBA)/Molecular Cell Research, 1867(2):118601. (год публикации - 2019) https://doi.org/10.1016/j.bbamcr.2019.118601.

2. Валяева А.А., Тихомирова М.А. , Поташникова Д.М., Арифулин Е.А., Горбачева М.А., Пенин А.А., Логачева М.Д., Богомазова А.Н., Жарикова А.А. , Саидова А.А., Мусинова Я.Р. , Миронов А.А., Васецкий Е.С., Шеваль Е.В. HIV-1 TAT индуцирует тканеспецифическую экспрессию генов в культивируемых B-лимфоцитах Гены и Клетки, научно практический журнал. Санкт-Петербург, Том XIV, № 3, 2019, cтр 32 (год публикации - 2019)

3. Васильченко-Базарова М.A., Жарикова А.A., Валяева А.A. , Поташникова Д.М., Тихомирова М.А., Мусинова Я.Р., Шеваль Е.В. Влияние индуцибельной и стабильной экспрессии TAT белка вируса иммунодефицита человека на экспрессию клеточных генов в культивируемых лимфоцитах RPMI 8866. «Гены и клетки» научно практический журнал. Санкт-Петербург, - (год публикации - 2020)

4. Горбачева М., Валяева А., Поташникова Д., Арифулин Е., Васецкий Е., Мусинова Я. HIV­1 Tat induces cell type ­specific expression of host genes in B­cells. Biopolymers and Cell, 35(3):225-226 (год публикации - 2019) https://doi.org/10.7124/bc.0009F0


Возможность практического использования результатов
В ходе реализации проекта нами получены данные о том, как Tat белок может способствовать развитию онкологических заболеваний у ВИЧ-инфицированных пациентов. Также впервые выявлено, что клетка способна компенсировать некоторые эффекты Tat белка. Это создает предпосылку для поиска способов предотвращения развития онкологических заболеваний у ВИЧ-инфицированных пациентов.