Аннотация результатов, полученных в 2014 году
В процессе работы была решена важная методическая задача, связанная с контаминацией коллоидных растворов окиси марганца ионами марганца, что недопустимо при исследовании накопления НЧ-MnO в органах животного методом магнитно-резонансной томографии (МРТ). Следует отметить, что во многих опубликованных работах отсутствует детальное изложение протоколов подготовки наночастиц к интраназальному введению. Эти может объясняться неоднозначность результатов разных авторов. Во-первых, обусловленный марганцем позитивный контраст на Т1 взвешенных изображениях не дифференцирует ионы и наночастицы. Во-вторых, как это показано в настоящем исследовании, наночастицы и ионы марганца оказывают разное, часто противоположное, действие на нервную систему. Для контроля ионной контаминации каждый образец перед интраназальным введением исследовали методом УФ-спектрометрии. Растворы, имевшие пик поглощения Mn2+, подвергали дополнительной отмывке от ионов. Накопление НЧ-MnO в лимбических структурах (связанных с эмоциональным и адаптивным поведением) имело четкую временную динамику. После введения в носовую полость концентрация НЧ-MnO (реконструированная по величине МРТ сигнала) достигала максимальных значений в обонятельных луковицах через 12 ч, в пиримофной коре через 24 ч, в зубчатой извилине через 96 ч. В наиболее удаленных по ходу лимбической системы основных ядрах stria terminalis (BSTN) накопление контраста наблюдалось вплоть до 10-х суток. При этом чем дальше от начала ольфакторной системы (обонятельные луковицы) находилась структура мозга, тем ниже были максимальные значения МРТ сигнала. Эту зависимость, построенную по 58 точкам на траектории «нанотрафика», с высокой степенью достоверности (p<0.001) описывало логарифмическое уравнение: МРТ сигнал, y.е. = -18.9*ln (N) + 77.8, где N номер точки по ходу нервных путей лимбической системы. Было установлено участие кальциевых каналов, эндоцитоза и тубулярного транспорта в механизме захвата и транспорта наночастиц в обонятельных луковицах. С помощью наночастиц PtO и просвечивающей электронной микроскопии было установлено, что все наночастицы имели только внутриклеточную локализацию и даже проникали в такие органеллы, как митохондрии. Важно подчеркнуть, что в тех отделах мозга, в которых методом МРТ не были выявлены магнитно-контрастные наночастицы оксида марганца, ПЭМ также не обнаруживал НЧ-PtO. Распределения НЧ-MnO, после многократного введения частиц или ионов, не отличалось от такового при однократной интраназальной аппликации наночастиц. Как и в случае однократного введения, марганец не детектировался на основе МРТ контраста в дофаминергических отделах мозга, таких как Caudate putamen. При сравнении интенсивностей МРТ сигнала при многократном и однократном введении НЧ-MnO достоверных отличий в ольфакторных луковицах, ольфакторном тракте и периморфной коре не обнаружено. Тогда как в области стриатума (substantia innomate, stria terminalis) и заднего гипофиза при многократном введении НЧ-MnO интенсивность МРТ сигнала была в 1,54±0,11раза выше, чем при однократном введении. Итак, длительное поступление наночастиц в носовую полость хотя и не влияет на характер пространственного распределения, но способствуют их большему накоплению в глубоких отделах головного мозга. Несмотря на то, что пространственные распределения МРТ контрастов, обусловленных накоплением НЧ-MnO или Mn2+, не различались, действие ионов марганца на мозг резко отличалось от действия наночастиц. Хроническое введение MnCl2 вызывало существенные нарушения гломерулярного слоя обонятельных луковиц. Эти выраженные морфологические изменения сопровождались существенными нейрохимическими нарушениями, а именно снижением уровня дофамина и его метаболита DOPAC, а также увеличением концентрации основного метаболита серотонина – 5-HIAA – после хронической аппликации MnCl2. Многократное введение MnCl2 достоверно увеличивало экспрессию генов, кодирующих 5-HT1A рецептор серотонина и провоспалительный цитокин TNFα. Кроме того, наблюдается увеличение (хотя и не достоверное) экспрессии генов других провоспалительных агентов, IL-6β, IL-6, iNOS в обонятельных луковицах после хронического введения MnCl2. Таким образом, полученные нами данные показывают, что поступление ионов марганца из носовой полости в мозг оказывает повреждающее воздействие на обонятельные луковицы подопытных животных. Следует отметить, что нарушения обонятельной системы относятся к ранним симптомам развития нейродегенеративных заболеваний и данный результат указывает на возможное участие растворимых аэрозолей марганца в развитии нейропатологий. Вместе с тем, несмотря на сопоставимое, судя по величинам МРТ контраста, накопление марганца при введении MnCl2 и НЧ-MnO, наночастицы не вызывали ни мофологических, ни нейрохимических изменений в структурах мозга. Возможно, для этого требуется более длительное воздействие наночастиц, а также проведение исследований на животных, предрасположенных к нейродегенеративной патологии.

Аннотация результатов, полученных в 2015 году
Доставка наночастиц к опухолям мозга разной локализации. Проведенное нами картирование перемещений магнито-контрастных наночастиц оксида марганца (MnO-НЧ) из носовой полости в головной мозг указывает на возможность применения интраназальных аппликаций для адресной доставки лекарственных препаратов к очагам нейропатологий. Данный подход был апробирован в экспериментах на иммунодефицитных мышах (линия SCID), которым за 4 недели до введения MnO-НЧ были инокулированы в разные отделы мозга клетки глиомы человека (U87). Накопление MnO-НЧ в опухоли определяли методом магнитно-резонансной томографии (МРТ) по величине позитивного контраста на Т1 взвешенных МРТ изображениях. Количественное соответствие между содержанием Mn в ткани и значениями МРТ контраста экспериментально обосновано (Moshkin et al., 2014). Было установлено, что введенные интраназально частицы накапливаются только в опухолях, расположенных вентро-латерально относительно таламуса и непосредственно прилегающих к нервным путям лимбической системы, по которой идет распространение MnO-НЧ. Опухоли, расположенные в районе четверохолмия, практически не накапливали наночастиц. Максимальные значения МРТ контраста, отмеченные через 96 часов после введения наночастиц в носовую полость, охватывали не более 30 % от размеров опухолей, что принципиально отличалось от распределения контраста при внутривенном введении MnO-НЧ. В этом случае область повышенного МРТ контраста уже через 24 часа охватывала все пространство опухоли, что указывает на проникновение наночастиц через фенестрированные капилляры глиом. Для объяснения частичного заполнения опухоли при введении MnO-НЧ в носовую полость следует обратиться к полученным ранее результатам электронно-микроскопического исследования распределения в мозге электронно-плотных частиц оксида платины (PtO-НЧ). Согласно этим исследованиям, через 96 часов после интраназальной аппликации коллоидного раствора PtO-НЧ входящие в его состав наночастицы были зарегистрированы только внутри нервных клеток. Вполне вероятно, что MnO-НЧ поступают в опухоль только в местах межклеточных контактов нейронов обонятельного тракта и клеток глиомы. Анализ распределения МРТ контраста при внутривенном введении MnO-НЧ показал, что используемые нами наночастицы не преодолевали гемато-энцефалический барьер (ГЭБ) в здоровых тканях мозга и накапливались только в глиомах. Эффективность ГЭБ по отношению MnO-НЧ доказывают также эксперименты с внутритрахеальным введением наночастиц. При контролируемом запрете на попадание наночастиц в носовую полость было установлено, что введенные в трахею MnO-НЧ перемещаются из легких в кровь и далее поступают в сердце, печень и почки, но не в головной мозг. Установленное в предыдущих исследованиях внутриклеточное распределение наночастиц при их инраназальном введении ставит вопрос о взаимодействии наноразмерных объектов с внутриклеточными белками. Ассоциация биомолекул с частицами может происходить либо по механизму стыковки с пористыми поверхностями (docking), либо по механизму обматывания вокруг наноразмерного объекта (wrapping). Для проверки этих гипотез мы инкубировали с лизатом клеток линии HeLa несколько типов наноразмерных частиц – частицы с «гладкой» поверхностью (площадь поверхности 170-200 м2/г) – Au, MnO, MnZnFe2O4, Gd2O3, SiO-S и пористые частицы (площадь поверхности 640 м2/г) – SiO-P. После осаждения частиц центрифугированием при 16000 об/мин супернатант убирали, переводили белки в денатурированное состояние и проводили электрофорез на полиакриловом геле. Далее с помощью масс-спектрометрии были идентифицированы белки супернатанта (более 3000 белков) и белки, связанные с наночастицами (60-120 белков). Больше всего белков было связано с оксидом гадолиния (Gd2O3), меньше всего – с частицами золота (Au). Оба типа частиц характеризуются «гладкой» поверхностью. Биоинформатический анализ показал, что связывание наночастиц происходит в основном с неструктурированными белками (коэффициент IUPred > 0,5, http://iupred.enzim.hu/). Это согласуется с представлениями о механизмах взаимодействия белков с поверхностями: эффективность Ван-дер-Вальсовых взаимодействий структурированных белков с пористой поверхностью значительно ниже по сравнению с неструктурированными. Таким образом, наночастицы в различной степени способны увеличивать преципитацию неструктурированной фракции цитоплазматических протеинов, к которым относятся белки цитоскелета и рибосомального аппарата, при попадании в клеточное ядро наночастицы могут вмешаться в нуклеосомную организацию генома. Накопление наночастиц в головном мозге предполагает их влияние на процессы нейроэндокринной регуляции, которые, в частности, проявляются в положительных ассоциациях между загрязнением воздушной среды ультратонкой пылью и частотой метаболических и психосоматических расстройств (Pearson et al., 2010; Rentschler et al., 2012). Для оценки патогенетической значимости интраназального поступления наночастиц в головной мозг мы исследовали координацию движений (ранний симптом Паркинсонизма) и липидного обмена у мышей, которым в течение 70 дней вводили в носовую полость (два раза в неделю) различные типы наночастиц. Эксперименты поставлены на 30 самцах мышей линии С57BL/6J, которые были поделены на 5 групп в зависимости от вводимых растворов: наночастицы оксида кремния (SiO2-НЧ), наночастицы MnO (MnO-НЧ), наночастицы Mn3O4 (Mn3O4–НЧ), раствор MnCl2, физиологический раствор (NaCl). Тестирование животных на 6-ю и 9-ю недели позволило выявить статистически значимые эффекты, обусловленные, с одной стороны, влиянием наночастиц, с другой – содержанием марганца в апплицируемых растворах. Введение наночастиц, независимо от химического состава, приводило к увеличению жира, содержание которого измеряли прижизненно с помощью низкопольного магнитно-резонансного томографа EchoMRI™-. С другой стороны, введение растворов, содержащих марганец (MnO-НЧ и Mn3O4-НЧ и MnCl2), вызывало нарушение координации движений, которое оценивали по времени, в течение которого мыши бегали на вращающемся валу прибора Rota Rod (UGO Basile, Италия). Следует отметить, что метаболические и нейротоксические эффекты наночастиц носят весьма умеренный характер, что может быть обусловлено их интраназальной аппликацией, а не ингаляцией, при которой воздействию подвергаются легкие и другие внутренние органы. Не исключено также, что мыши линии C57Bl/6J слабо восприимчивы к действию наночастиц. Как показали наши исследования, физиологические эффекты наноразмерных аэрозолей, образованных оксидами металлов, обусловлены не только их поступлением в головной мозг. В частности, при интраназальной аппликации оксидов платины (PtO-НЧ) и палладия (PdO-НЧ) мы наблюдали падение температуры тела на 5-6 °С через 80-100 мин после введения наночастиц. Такой быстрый эффект нельзя объяснить прямым влиянием на центры терморегуляции, которые наночастицы достигают не ранее чем через 12-18 часов. Генетическая изменчивость гипотермического эффекта ноночастиц была исследована на 6 инбредных (BALB/cJ, C57BL/6J , AKR/OlaHsd, DBA/2JRccHsd, C3H/HeNHsd, SJL/J) и 2 аутбредных линиях (SCID и CD1) мышей. Наиболее выраженное снижение температуры в ответ на интраназальное введение PtO-НЧ продемонстрировали мыши линий BALB/cJ и SCID, при этом амплитуда падения температуры тела в ответ на введение PtO-НЧ была больше, чем на введение прекурсора данных частиц - K2PtCl4. Следует отметить, что ни внутривенное, ни пероральное введение наночастиц не вызывало значимых изменений температуры тела. Быстрое развитие реакции и ее отсутствие при внутривенной инъекции указывает на то, что объяснение феномена следует искать в нервных или гуморальных посредниках гипотермического эффекта, обусловленного попаданием наночастиц в носовую полость. Для продвижения в данном направлении большое значение имеет установленная в отчетный период причина неодинакового гипотермического эффекта PtO-НЧ и PdO-НЧ, которые при одинаковом химическом составе и одинаковых размерах либо влияют, либо не влияют на температуру тела мышей. Демаркационным свойством наночастиц оказалась их способность закислять коллоидные растворы. Например, интраназальная аппликация раствора PdO-НЧ(1) с pH = 2,8 вызывала падение температуры более чем на 6 °С, а аппликация раствора PdO-НЧ(2) с pH = 4,5 не влияла на температуру тела. Причем снижение pH добавлением в раствор HCl не отражалось на гипотермическом эффекте. Эти данные дают основание предположить, что эффективные в плане терморегуляции наночастицы имеют избыточные протоны (так называемые протонные губки), которые при эндоцитозе вызывают закисление внутриклеточной среды в клетках слизистой носа и гайморовых пазух. Одним из следствий снижения pH внутри клетки может быть высвобождение АТФ и ее производных, в частности, аденозина. Первое подтверждение этой гипотезы получено в эксперименте с применением аминофиллина – неселективного блокатора аденозиновых рецепторов. Внутрибрюшинное введение блокатора за 5 мин до аппликации наночастиц предотвращало гипотермический эффект PdO-НЧ. Продолжение работ в данном направлении имеет серьезные фундаментальные и прикладные перспективы. Эти работы могут пролить свет на механизмы ухудшения самочувствия людей, вплоть до случаев внезапной смерти, что наблюдается при повышении концентрации ультратонкой пыли в атмосфере. Они также могут быть использованы при формировании регламентов оценки загрязнения среды наночастицами, которые, в дополнение к известным параметрам, должны учитывать способность частиц снижать pH коллоидных растворов. В рамках проекта были выполнены работы по моделированию паркинсонизма путем введения нейротоксина 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридина (MФTП), который вызывает массовую гибель дофаминовых нейронов в черной субстанции. Однако эффективного нейротоксического эффекта достичь не удалось. Поэтому будет проведен поиск других моделей индуцированного паркинсонизма, например, с помощью введения наночастиц животным генетических линий, предрасположенным к данной патологии.

Аннотация результатов, полученных в 2016 году
В работах отчетного периоды были стандартизированы все этапы количественной оценки пространственно-временной динамики перемещения наночастиц из носовой полости в мозг, включая: (1) разработку протоколов получения кристаллических и аморфных магнито-контрастных наночастиц оксидов марганца с минимально варьирующими размерами; (2) подготовку на их основе коллоидных растворов со стабилизацией наночастиц, в том числе показавшими наибольшую эффективность фибриллярными белками; (3) подбор условий для контролируемого повышения проницаемости мукозального слоя обонятельного эпителия; (4) выбор оптимальной последовательности мониторинга аксонального транспорта наночастиц методом магнитно-резонансной томографии (МРТ); (5) разработку и апробации подходов к воспроизводимой количественной оценки интенсивности МРТ сигнала на Т1взвешенных изображениях; (6) экспериментальную калибровку соответствия величины МРТ сигнала содержанию Mn в тканях мозга; (7) разработку алгоритмов количественного описания нанотрафика с оценкой характеристических параметров накопления и выведения магнито-контрастных агентов. Решение всех перечисленных задач позволило впервые количественно описать процесс поступления наночастиц с поверхности обонятельного эпителия в глубокие структуры мозга. Траектория перемещения магнито-контрастных наночастиц Mn3O4-НЧ, полученная в результате мониторинга динамики МРТ контраста на Т1 взвешенных имиджах, была строго приурочена к структурам лимбической нервной системы. В результате аппроксимации эмпирических данных на основе кумулятивной функции распределения Вейбулла было установлено, что время и максимальная скорость накопления наночастиц существенно различаются между нейрональными ядрами. При этом среднее время накопления наночастиц в основной обонятельной луковице (MOB) было почти в 20 раз меньше, чем в ядрах бледного шара (GP). Различия по скорости накопления наночастиц находились в хорошем соответствии с трактографией нервных связей в лимбической системе. Об этом свидетельствует тот факт, что число синапсов, которые должны преодолеть наночастицы по минимальной траектории от гломерулярного слоя MOB до каждой конкретной структуры, высоко достоверно коррелировало с временем достижения максимального МРТ контраста (r = 0.83, p < 0.001). В отличие от параметров накопления наночастиц, время (средняя и медиана) и максимальная скорость их выведения не различались между структурами лимбической системы даже на уровне статистической значимости. Это указывает на различные механизмы накопления и выведения наночастиц. Если в первом случае основную роль играет скорость движения транспортных белков и эффективность процессов прохождения частиц через синапсы, то во втором потеря МРТ контраста может быть обусловлена растворением Mn3O4-НЧ, которое начинается сразу же после их попадания в кислую среду лизосом. Время полного освобождения нейрональных структур от наночастиц (~ 1 месяца) вполне согласуется с кинетикой их растворения в кислой среде (pH ~ 4). Следовательно, параметры накопления в большей степени, чем выведения, зависят от морфофункционального состояния нейронов лимбической системы, в частности от энергетического обеспечения транспортных процессов. Поэтом их количественная оценка может служить средством диагностики, по крайней мере, в экспериментальных исследованиях. Вместе с тем, определение параметров выведения, которое растягивается на сотни часов, также имеет значение, как количественный ориентир для времени пребывания наночастиц, в том числе и терапевтического назначения, в конкретной структуре мозга. Первые результаты, подтверждающие диагностическую ценность количественной оценки поступления наночастиц из носовой полости в мозг, были получены при исследовании мышей линии SCID (SHO-PrkdcscidHrhr) с экспериментальной нейропатологией – глиобластома U87, инокулированная в гиппокамп. Развитие опухоли существенно влияло на динамику накопления наночастиц в отдельных, но не во всех, структурах лимбической системы. Так, в передних обонятельных ядрах (AON) имело место значительное снижение темпов роста МРТ контраста, а в субвентрикулярной зоне этого не наблюдалось. Уменьшение скорости накопления наночастиц в AON является следствием замедления аксонального транспорта на участке MOB – AON, т.е. в проводящих путях, расположенных вне опухоли. Последнее положение подтверждает определение границ опухоли на Т2 взвешенных изображениях мозга. Следовательно, изменения скорости транспорта наночастиц отражают генерализованные нарушения морфофункционального состояния головного мозга, выходящие за пределы патологического очага. Изучение на мышах линии BALB/c гипотермического эффекта интраназальной аппликации коллоидных растворов, приготовленных на основе 16 типов наночастиц оксидов металлов, показало, что только 4 из них оказываются эффективными. При разведении этих частиц мы получали растворы с pH < 4. Это свидетельствует о том, что взаимодействие наночастиц с водой приводит к выделению протонов. Коллоиды с большими значениями рН не влияли на температуру тела подопытных животных. Этот результат должен привлечь внимание нанотоксикологов, которые в своих оценках потенциальной опасности наноразмерных аэрозолей руководствуются их гидродинамическими размерами, дзета-потенциалом и химическим составом. Вместе с тем, как показывают нашим исследования оксиды палладия и оксиды платины, полученные разными способами и, соответственно, различающиеся по способности закислить коллоидные растворы принципиально отличаются и по величине гипотермического действия. Начатая в наших исследованиях расшифровка механизмов гипотермического эффекта показала, что блокирование экзо- и эндоцитоза в клетках обонятельного эпителия, а также блокирование центральных аденозиновых рецепторов, полностью подавляет влияние на температуру тела интраназальной аппликации наночастиц. Причем участие блокатора (Glybenclamide) каналов Kir6.x рецепторов в реализации гипотермического действия наночастиц, отчасти, объясняет существенные межлинейные различия данной реакции. Каналы этого типа экспрессированы в обонятельном эпителии мышей линии BALB/c, которые реагируют на аппликацию наночастиц, но они отсутствуют у мышей C57BL/6j, которые не реагируют на наночастицы. Таким образом, выявлен кандидатный ген, полимофизм которого может вносить вклад в изменчивость нейрофизиологических реакций людей на загрязнение воздуха наноразмерными аэрозолями. Еще один практически значимый результат, полученный в данном исследовании, заключается в том, что при выяснении терморегуляторной роли АТФ, выделяемой гайморовыми пазухами, было установлено, что для одинакового гипотермического эффекта при интраназальном или внутривенном введением АТФ в первом случает требуется в 10 раз меньше препарата, чем во втором. При попытках объяснить эпидемиологические и токсикологические последствия загрязнения атмосферного воздуха наноразмерными аэрозолями существенное значение имеет обоснованное знание биологических эффектов, обусловленных разными путями поступления к органам мишеням разных типов наночастиц. В исследованиях, выполненных в текущем году, мы получили доказательства ограниченной эффективности кристаллических наночастиц Mn3O4-НЧ. Было установлено, что уже после однократной интраназальной аппликации падает проницаемость мукозального слоя обонятельного эпителия и, как следствие, не происходит накопления наночастиц при их последующем введении. Вместе с тем, само по себе изменение вязкости мукозального геля не остается бесследным. На этом фоне нарушается запаховое восприятие, которое может быть причиной вторичных метаболических нарушений, обусловленных изменениями пищевого поведения. Согласно клиническим наблюдениям, различные варианты аносмии или гипоосмии являются факторами риска ожирения, обусловленного нарушением способности к выбору «здоровой» пищи (Mariman et al., 2016; Pastor et al., 2016). Проведенные в рамках проекта испытания нейротропного соединения (1R,2R,6S)-3-метил-6-(проп-1-ен-2-ил)циклогекс-3-ене-1,2-диол (Диол) показали его нулевую эффективность в плане коррекции поведения у мышей линии B6.Cg-Tg (Prnp-SNCA*A53T) 23Mkle/J с увеличенной экспрессией человеческого альфа-синуклеина в мозге. Возможно, отрицательный результат был связан с тем, что у шести-месячных мышей еще не развились признаки врожденной патологии. В заключение можно выделить следующие наиболее значимые результаты 2016 г.: а) разработан и апробирован алгоритм количественного описания процессов поступления магнито-контрастных наночастиц из носовой полости в мозг; б) получены первые результаты, обосновывающие диагностическую перспективность количественных измерений процессов перемещения нанообъектов по нервным путям; в) при изучении гипотермических эффектов наночастиц установлена биологическая значимость такого их свойства, как наличие свободных протонов, закисляющих коллоидные растворы; г) для кристаллических наночастиц Mn3O4-НЧ впервые установлена их способность снижать проницаемость мукозального слоя обонятельной выстилки, что приводит к нарушениям запахового восприятия. В целом, выполнения проекта позволило решить ряд фундаментальных и прикладных задач, крайне актуальных для современного состояния исследований в области нанобиобезопасности и наномедицины.