Аннотация результатов, полученных в 2016 году
Осуществлен синтез, выявлено противоопухолевое действие и проведен анализ структура-активность 24 конъюгатов лупановых тритерпеноидов с митохондриально тропным трифенилфосфониевым катионом (TPP+), в которых молекулы тритерпеноидов связаны полиметиленовыми или полиэтиленгликолевыми спейсерами с одним или двумя трифенилфосфониевыми катионами при С-2, С-28 или С-30 позициях через углерод-углеродную или сложноэфирную связи. Разработан препаративно простой двухстадийный синтез С(30)-аллильных трифенилфосфониевых солей через промежуточные С(30)-аллильные бромиды. В коньюгацию вовлечена большая группа тритерпеноидов, содержащих при С-3 и/или С-28 атомах лупанового скелета заместители, усиливающие цитотоксический эффект нативных соединений: 3β-О-фталевый эфир бетулиновой кислоты, 28-конъюгаты бетулиновой кислоты с природными аминокислотами и лупановые тритерпеноиды с модифицированным кольцом А, содержащим 1,2-еноновый фрагмент. Синтезированы производные бетулиновой кислоты с трифенилфосфониевым катионом, соединенным с молекулой тритерпеноида при С(2)-атоме кольца А через триметиленовый мостик прочной углерод-углеродной связью. Разработаны методы синтеза моно- и дифосфониевых производных лупановых тритерпеноидов, в которых катионы трифенилфосфония коньюгированы с 28-карбоксильной функцией сложноэфирной связью через полиметиленовые или полиэтиленгликолевые спейсеры. Полученные соединения в отличие от биохимически стабильных трифенилфосфониевых солей из группы С(2)-TPP+ и C(30)-TPP+ могут подвергаться гидролизу под действием эндогенных эстераз и иметь другие биокинетические характеристики. Тестирование in vitro на противораковую активность катионных производных лупановых тритерпеноидов проведено в Национальном институте рака США (NCI) и в организации соисполнителе проекта «ООО Инновационные фармакологические разработки» (ООО «Ифар», г.Томск). Все полученные соединения проявили цитотоксическое действие в низких микромолярных концентрациях. Новый фармакофорный фрагмент в ряду пентациклических тритерпеноидов - трифенилфосфониевый катион значительно усилил противоопухолевое действие бетулиновой кислоты. При этом отсутствовала зависимость цитотоксической активности исследуемых соединений от структуры тритерпенового скелета. С целью выполнения раздела проекта, направленного на получение коньюгатов пентациклических тритерпеноидов лупанового, урсанового и олеанового ряда с низкомолекулярными полигидроксильными соединениями разработан универсальный синтетический подход для введения легко трансформируемых алкинильных групп в С-2 позицию кольца А пентациклических тритерпеноидов. Найдены условия реакции, позволившие получить С-2-альфа пропаргильные производные тритерпеновых кислот с высокой стереоселективностью при отсутствии побочных продуктов О-алкилирования, полиалкилирования и ацетилен-алленовой изомеризации. Полученные С(2)-алкинильные и С(2)-бис-алкинильные производные новых тритерпеноидов вовлечены в клик-синтез с азидами моно-, дисахаридов и их перацетилированных производных (бета-D-глюкоза, альфа-D-манноза, бета-D-галактоза и лактоза).

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Митохондриально направленные трифенилфосфониевые производные бетулиновой и урсоловой кислот: синтез и исследование механизма противоракового действия. Пентациклические тритерпеноиды лупанового и урсанового типа (бетулин, бетулиновая и урсоловая кислоты) относятся к числу наиболее распространенных в растительном мире вторичных метаболитов терпеновой структуры. Эти соединения представляют интерес для фармакологических исследований, поскольку проявляют широкий спектр биологических свойств. Особый интерес вызывает их противоопухолевая активность и способность инициировать митохондриальный путь апоптоза в различных типах раковых клеток человека. Привлекательность этих природных соединений обусловлена также отсутствием их цитотоксического действия в отношении нормальных клеток человека (фибробластов или пролиферирующих нормальных лимфоцитов) и незначительной системной токсичностью в in vivo-экспериментах с использованием моделей ксенотрансплантатов. Однако относительно низкий противоопухолевый потенциал и высокая гидрофобность тритерпеновых кислот заметно затрудняют их продвижение в медицину. Недавно конъюгация с липофильным митохондриотропным трифенилфосфониевым катионом (ТРР +) стала активно использоваться для повышения эффективности и селективности митохондриально нацеленных противораковых средств. Синтез положительно заряженных соединений путем связывания с TPP +-группой усиливает митохондриальное нацеливание и позволяет снизить дозы цитотоксического вещества. Ранее (2016 год) мы синтезировали конъюгаты лупановых тритерпеноидов с катионом трифенилфосфония (TPP +), которые проявили цитотоксичность in vitro при низких микромолярных концентрациях и значительно превысили противоопухолевую активность бетулиновой кислоты. В этом году мы синтезировали новую серию трифенилфосфониевых солей бетулиновой и урсоловой кислот и исследовали их цитотоксическую активность в отношении трех линий раковых клеток человека, а также их способность индуцировать запрограммированную гибель раковых клеток с использованием маркеров апоптоза, таких как активация каспазы-3, расщепление PARP-1, пермеабилизация наружной митохондриальной мембраны, реализация цитохрома c и ингибирование митохондриальной дыхательной цепи. (Работа выполнена при сотрудничестве с Факультетом фундаментальной медицины, Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова и компанией Инновационные фармакологические разработки, г. Томск). Группа трифенилфосфония была связана с молекулой бетулиновой или урсоловой кислоты в положении С-28 тритерпеноидного скелета через гидрофобный бутановый или гидрофильный триэтиленгликолевый-спейсеры. В попытке усилить противоопухолевую активность трифенилфосфониевых солей мы связали 3-бета-ОН-группу в терпеноидах с молекулой дихлорацетата, известным ингибитором киназы пируватдегидрогеназы (PDK). Трифенилфосфониевые соли бетулиновой и урсоловой кислот, содержащие триэтиленгликолевый мостик, были получены путем алкилирования 28-карбоксильной группы тритерпеноидов дибромидом триэтиленгликоля в ДМФА. Дибромиды синтезировали из диэтилтозилата триэтиленгликоля обработкой LiBr в кипящем ацетоне. В экспериментах in vitro на трех линиях раковых клеток человека (MCF-7, HCT-116 и TET21N) все полученные трифенилфосфониевые производные тритерпеновых кислот не только показали более высокую цитотоксичность по сравнению с бетулиновой кислотой, но также значительно превосходили ее способность индуцировать митохондриально-зависимый апоптоз в исследуемых раковых клетках. Новые производные тритерпеновой кислоты приводили к активации апоптотической эффекторной каспазы-3, расщеплению PARP, проницаемости митохондриальной наружной мембраны и высвобождению цитохрома c (митохондриального апоптогенного белка) из митохондрий в цитозоль раковых клеток. Они индуцировали повреждение ДНК, уменьшали потребление кислорода раковых клеток и ингибировали митохондриальную дыхательную цепь. Величина IC50 была намного ниже для всех трифенилфосфониевых производных по сравнению с бетулиновой кислотой. Из испытуемой группы конъюгатов наиболее сильную токсичность проявил конъюгат бетулиновой кислоты 9 (для 9 значение IC50 против клеток MCF-7 и TET21N составляло 0,70 мкМ и 0,74 мкМ, для бетулиновой кислоты (BA) IC50> 25 мкМ против клеток MCF-7). Синтез новых С-2 триазол-связанных аналогов сапонинов пентациклических тритерпеноидов. Получены ранее неизвестные 1,2,3-триазольные конъюгаты лупановых, урсановых и олеановых тритерпеноидов с моно- и дисахаридами, на основе катализируемой CuI реакции 1,3-диполярного циклоприсоединения азидов к ацетиленам (CuAAC). Для получения триазолилгликопиранозидов тритерпеноидов использованы С-2 пропинильные производные бетулиновой, урсоловой и олеаноловой кислот. Эти исходные субстраты с терминальной ацетиленовой группой стали доступными в результате недавно разработанной нами реакции α-алкилирования пропаргилбромидом енокситриэтилборатов калия, полученных из 3-кето тритерпеноидов. С целью оценки в будущих фармакологических исследованиях взаимосвязи структура-цитотоксическая активность в конъюгатах проварьирован тип тритерпеноидного агликона и тип сахарных звеньев, а триазольное кольцо спейсерировано с сахарным фрагментом через N-гликозидную или О-гликозидную связи. Синтезированы бис-триазол-связанные аналоги сапонинов лупановых тритерпеноидов. Для конструирования в гликозилированных тритерпеноидах бис-триазольного линкера использовано трехкомпонентное циклоприсоединение азида натрия и эпихлоргидрина к пропаргилгликозидам, протекающее с региоселективным раскрытием оксиранового кольца эпихлоргидрина в условиях CuAAC. Цитотоксическая активность полученных гликозидных производных тритерпеноидов изучена по стандартной методике в Национальном институте рака США (NCI) на панели, состоящей из 60 линий опухолевых клеток человека (лейкемия, меланома, рак легких, толстой кишки, почек, яичников, молочной железы, предстательной железы и центральной нервной системы). Некоторые из синтезированных соединений проявили слабое цитотоксическое действие.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
1. Синтез и исследование противоопухолевой активности новых C-28-гуанидин-функционализированных производных тритерпеновых кислот. Одним из эффективных подходов к улучшению биодоступности и селективности биологического действия тритерпеновых соединений может быть их модификация в катионные производные, такие как кватернизованные аммониевые -, пиридиновые- или трифенилфосфониевые соли.. В развитие работы по поиску эффективных и селективных противоопухолевых лекарственных средств нами синтезированы и исследованы на цитотоксическую и апоптоз индуцирующую активность новые катионные производные пентациклических тритерпеноидов, содержащих в своей структуре гуанидиниевые группы, легко протонирующиеся при физиологических значениях pH. Введение гидрофильных гуанидиниевых заместителей в гидрофобные молекулы тритерпеновых кислот может привести к усилению их трансмембранного переноса и улучшению физико-химических характеристик. При этом новые гибридные молекулы могут сохранить характерную для природных тритерпеновых кислот селективность цитотоксического действия в отношении клеток здоровых тканей. Цитотоксическую активность гуанидиниевых солей тестировали in vitro на пяти опухолевых клеточных линиях человека. Возможная клеточная токсичность исследована на нормальных клетках человека (human fibroblast). Гуанидин-функционализированные тритерпеноиды демонстрировали значительно более высокую противораковую активность в Jurkat клетках в сравнении с исходными природными тритерпеновыми кислотами. Введение в молекулы тритерпеновых кислот фрагмента трис(гидроксиметил) аминометана оказало значительное влияние на усиление противоопухолевого действия полученных коньюгатов независимо от структуры тритерпенового ядра. Эти соединения, представляющие собой структурные аналоги известного противоопухолевого агента NVX-207, были выбраны как молекулы-лидеры для исследования механизма их противоопухолевой активности с использованием метода проточной цитометрии. Бетулиновая кислота вызывала апоптоз в клетках Jurkat в более высоких дозах (IC50 50 мкМ) по сравнению с выявленными соединениями-лидерами(4 мкМ). ДНК-проточная цитометрия использовалась также для анализа кинетики клеточного цикла в клетках Jurkat, предварительно инкубированных с бетулиновой кислотой и гуанидиниевыми производными при их концентрации IC50 в течение 24 и 48 часов. Результаты экспериментов свидетельствовали о значительной остановке S-фазы в клетках после обработки всеми тестируемыми соединениями. Наблюдалось соответствующее уменьшение количества клеток в фазе G2/M. Учитывая эти результаты, мы предположили, что бетулиновая кислота и полученные гуанидиниевые производные бетулиновой. урсоловой и олеаноловой кислот способны инициировать запрограммированную гибель клеток, включая апоптотические механизмы и остановку клеточного цикла в S-фазе Гуанидиниевые производные тритерпеновых кислот, были испытаны также на антимикробную активность. Тестирование проводилось на культурах грамм положительных и грамотрицательных бактерий, а также на культурах двух грибов, Candida albicans и Cryptococcus neoformans. Гуанидиниевые соли были неактивны в отношении грамотрицательных бактерий (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa), но продемонстрировали хорошую антибактериальную активность в диапазоне MIC 0,5-4,0 Мкg/mL против грамположительных бактерий S. aureus, в то время как бетулиновая кислота была не активна (MIC > 256 Мкg/mL). Антифунгальная активность гуанидиниевых солей в отношении C. neoformans (МIC< 0.25 мкг/мл) была значительно выше активности известного противогрибкового препарата флуконазола (MIC=8.0 мкг/мл). Таким образом, введение катионных гидрофильных гуанидиниевых заместителей в гидрофобные молекулы бетулиновой, урсоловой и олеаноловой кислот привело к значительному усилению противоопухолевой, и антимикробной активности этих природных веществ. 2. Синтез новых С-2 триазол-связанных коньюгатов бетулиновой кислоты с азидотимидином (AZT) в качестве потенциальных анти-ВИЧ агентов. В настоящее время при создании новых анти-ВИЧ препаратов особое внимание уделено соединениям, которые по возможности могут действовать на две и более молекулярные мишени и быть активными на разных стадиях репликационного цикла ВИЧ. С целью разработки новых эффективных, мультитаргетных анти-ретровирусных лекарств нами выполнена фармакофорная гибридизация препарата Бевиримат (3-О диметилсукцинат бетулиновой кислоты, известный ингибитор созревания ВИЧ на поздней стадии репликации), а также некоторых других производных бетулиновой кислоты с AZT (3'-азидо-3'-дезокситимидин, первый клинически доступный нуклеозидный ингибитор обратной транскриптазы ВИЧ). Комбинация двух фармакологически активных молекул в гибридные соединения осуществлена через медь-катализируемое 1,3-диполярное циклоприсоединение (CuACC-реакция), в котором исходными субстратами послужили С-2 пропинильный аналог бевиримата, и другие С-2 ацетилен содержащие тритерпеноиды с 3,28 фармакофорными боковыми цепями. В результате, синтезирована линейка потенциальных мультитаргетных анти-ВИЧ агентов, содержащих в одной молекуле несколько фармакофорных групп, направленных как мы предполагаем, на разные молекулярные мишени, ответственные за реализацию жизненного цикла вируса. 3. Удобный одностадийный синтез смоляно-кислотных оснований Манниха. Новые противоопухолевые и противогрибковые препараты. Впервые осуществлено аминометилирование пропаргиловых эфиров абиетановых дитерпеноидов путем катализируемой однохлористой медью однореакторной трехкомпонентной реакции с формальдегидом и вторичными аминами. Установлено, что при хлорангидридном синтезе пропаргилового эфира абиетиновой кислоты в результате взаимодействия с оксалилхлоридом и диметилформамидом, наряду с образованием эфира, протекают реакции формилирования в положение С-7 кольца В с образованием формилпроизводного и дегидрирования цикла С с образованием эфира дегидроабиетиновой кислоты. Изучена цитотоксическая, и антимикробная активность in vitro полученных соединений. Обнаружена способность 7-формилпроизводного абиетиновой кислоты, содержащего пирролидиновый остаток, эффективно ингибировать рост культуры бактерий Staphylococcus aureus, а также культур грибков Candida albicans и Cryptococcus neoformans. 4. Синтез и изучение противоопухолевой активности нитрильных производных трициклических дитерпеноидов абиетанового ряда. Осуществлен синтез и изучена противоопухолевая активность in vitro новых цианэтильных производных дигидрохинопимаровой кислоты. Для бис- и трицианэтильных производных дитерпеноидов проведена оценка противоопухолевого действия in vitro в отношении клеточных линий Jurkat, K562, U937 и HeLa, включающая определение CC50, изучение апоптоз индуцирующей активности и влияния на клеточный цикл посредством проточной цитофлуориметрии. Наибольшую цитотоксичность против всех четырех исследуемых опухолевых линий проявило трицианэтильное производное дитерпеноида, оказавшееся в 2 раза активнее препарата сравнения камптотецина. Для этого соединения, были выполнены исследования по изучению индукции апоптоза и влияния на клеточный цикл клеток Jurkat с привлечением проточной цитофлуориметрии.. Полученные данные свидетельствовали о способности исследуемого соединения вызывать гибель опухолевых клеток по апоптотическому пути. Анализ показателей кинетики клеточного цикла клеток линии Jukart, определяемых методом проточной ДНК-цитометрии, показал, что исследуемое соединение оказывает преимущественное воздействие на S и G2 фазы клеточного цикла, причем данное воздействие было дозозависимомо. Наибольшие изменения S и G2 фазы возникали при экспозиции исследуемого вещества в концентрации 0.1 µM.