Аннотация результатов, полученных в 2016 году
Разработаны подходы к получению новых полифторалкилсодержащих азолов как аналогов нестероидных противовоспалительных препаратов ряда пиразолонов и коксибов. Предложен эффективный метод получения 2-гидроксиимино-3-полифторалкилпиразол-5-онов за счет прямого нитрозирования 3-полифторалкилпиразол-5-онов нитритом натрия в уксусной кислоте. По данным спектроскопии ЯМР для 2-гидроксиимино-3-полифторалкилпиразол-5-онов характерна нитрозоеноло-гидроксииминокетонная таутомерия. Показано, что для синтеза гидрохлоридов 4-амино-3-полифторалкилпиразол-5-онов эффективным является восстановление 4-гидроксииминопиразолонов в соляной кислоте под действием хлорида олова(II), тогда как использование в качестве восстановительной системы цинка в уксусной кислоте приводит к образованию 4-{[5-гидрокси-1-фенил-3-полифторалкил-1H-пиразол-4-ил]имино}-2-фенил-5-полифторалкил-2,4-дигидро-3H-пиразол-3-онов. Это обусловлено склонностью свободных оснований 4-аминопиразолонов к окислению с образованием рубазоновых кислот. Найдено, что циклоконденсация полифторсодержащих 2-арилгидразоно-3-оксоэфиров с гидрохлоридом гидроксиламина протекает региоспецифично с образованием 3-полифторалкил-4-арилгидразоноизоксазол-5-онов, которые использованы в качестве исходных соединений для получения 4-аминоизоксазол-5-онов. Для биологического тестирования синтезированы аналоги целебрекса, модифицированные по положению 4 различными азагруппами. Для этого реакциями азосочетания и нитрозирования получены 2-арилгидразоно- и 2-гидроксииминозамещенные 1,1,1-трифтор-4-толилбутан-2,4-дионы, которые далее введены в циклизацию с 4-аминосульфофенилгидразином в результате чего получены 4-арилазо- и 4-нитрозозамещенные аналоги целебрекса. Для синтеза 2-аминосодержащего производного наиболее эффективным оказалось восстановление 2-гидроксииминопиразол-5-она хлоридом олова(II) в соляной кислоте. Выполнены исследования по модификации полифторалкилсодержащего пиразольного остова за счет реакций N-метилирования. Найдено, что метилирование в присутствии основания независимо от метилирующего агента предпочтительно проходит по атому азота при нефторированном заместителе с образованием 3-RF-пиразолов, в то время как реакции с диметилсульфатом в отсутствии основания реализуются большей частью по атому азота при полифторалкильной группе, давая 5-RF-пиразолы. Для объяснения механизма реакций проведено компьютерное моделирование реакции с помощью теории функционала плотности. Установлено, что метилирование в основных условиях протекает через промежуточное образование солей анионного типа, при этом направление метилирования обусловливается термодинамической устойчивостью конечных продуктов. В отличие от этого метилирование в отсутствии основания протекает через промежуточное образование катионной соли, формирующейся в результате метилирования пиридинового атома пиразола, при этом направление метилирования определяется преимущественностью существования исходных пиразолов в одной таутомерной форме, имеющей C=N связь при полифторированном заместителе. Найденный метод селективного метилирования может быть использован для целенаправленного получения 3-RF- или 5-RF-пиразолов. Нами разработан препаративный универсальный метод синтеза полифторсалициловых кислот через нуклеофильное орто-монозамещение атома фтора в коммерчески доступных полифторбензойных кислот под действием метоксида магния. При этом выходы целевых полифторсалициловых кислот увеличены до количественных. Разработка удобных методов получения полифторсалициловых кислот позволила нам осуществить их химическую модификацию и выполнить исследование их биологической активности. Синтезированы полифторированные аналоги известных клинически применяемых салицилатов в результате трансформаций полифторсалициловых кислот по карбоксильной и гидроксильной функциям. Молекулярный докинг синтезированных полифторсалицилатов в тирозиновый сайт циклооксигеназы-1 показал их хорошее связывание с нативным лигандом. Впервые изучено биологическое действие полифторсалицилатов in vitro (проницаемость через биологические мембраны, ингибирование ЦОГ-1) и in vivo (противовоспалительная, анальгезирующая, туберкулостатическая активности и острая токсичность). Эти эксперименты позволили выявить соединения-лидеры в ряду полифторсалицилатов, которыми оказались трифтор- и тетрафторсалициловые кислоты, а также ацетильное производное тетрафторсалициловой кислоты, проявившие анальгезирующее действие на уровне диклофенака. Оценка биодоступности полифторсалицилатов выполнена с помощью расчетных методов значений их липофильности (СlogP) и проницаемости через липидные мембраны in vitro. Найдено, что фторированные производные показывают лучшую способность к диффузии по сравнению с нефторированными аналогами. Острая токсичность фторированных производных оказалась выше, чем токсичность ацетилсалициловой кислоты. Однако производные дифторзамещенных кислот менее токсичны, чем три- и тетрафторзамещенные производные. Синтезированные полифторсалициловые кислоты показали значительную активность против штаммов микобактерий туберкулеза H37Rv, M. avium, M. terrae и MЛУ, проявив минимальную ингибирующую активность в концентрациях от 0.7 до 6.5 мг/мл в зависимости от их строения. При этом 2-гидрокси-4,5-дифторбензойная кислота сочетает высокую активность с низким LD50.

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Разработаны методы получения 1-арил-3-полифторалкилпиразол-5-олов как фторированных аналогов антипирина и их изомеров, 1-арил-5-метокси-3-полифторалкилпиразолов, имеющих структурное сходство с целекоксибом. Для этого исследованы реакции метилирования 1-арил-3-полифторалкил-5-пиразололов, в результате чего предложены удобные методы для их хемоселективного O- и N-метилирования, а также установлены характеристичные признаки для определения строения изомерных продуктов. Переисследована структура исходных пиразолов, при этом опровергнуты литературные данные о существовании 1-фенил-3-трифторметилпиразола в виде пиразол-5-она и доказано, что для него характерна ОН-форма, стабилизированная межмолекулярными водородными связями. Установлено строение 3-трифториметилпиразол-5-ола и изучены реакции его метилирования. В результате широкого варьирования условий этих реакций подобраны условия для селективного получения всей гаммы возможных продуктов моно- и диметилирования. Региоизомерное строение всех продуктов доказано с привлечением комплекса методов физико-химического анализа. Найдено, что использование в качестве метилирующего реагента диметилацеталя диметилформамида приводит к С-аминометилидированию 3-трифториметил-5-пиразололов. Получены 4-(гет)арилазозамещенные аналоги целекоксиба, а также изомерные 5-трифторметил-5-гидроксипиразолины. Использование в качестве гетариламинной компоненты аминоантипирина позволило получить производное, в котором через азо-мостик соединены два биоактивных соединения (целебрекс и антипирин). Для модификации пиразольного остова целекоксиба по положению С4 использованы реакции кросс-сочетания по Сузуки, в результате чего получены 4-(гет)арилзамещенные пиразолы. Найдено, что 4-бром- и 4-фенилзамещенные трифторметилпиразолы проявляют туберкулостатическую активность на уровне препарата пиразинамид. Реализован синтез полифторалкилсодержащих изоксазолов как аналогов вальдекоксиба в результате региоселективной циклизации 4-арилгидразоно-1,3-дикетонов с гидрохлоридом гидроксиламина. Разработан метод синтеза 4-амино-3-полифторалкилпиразолов в результате восстановления их нитрозозамещенных предшественников, для получения которых предложено использовать one-pot метод, основанный на нитрозировании 1,3-дикетонатов лития и последующей конденсации промежуточных 2-гидроксиимино-1,3-дикетонов с гидразинами. Продемонстрирована возможность вовлечения 4-аминопиразолов в реакции с альдегидами по аминогруппе с образованием азометиновых производных. Предложен подход к модификации пиразольного остова по эндоциклическим атомам азота. Обнаружена новая реакция региоселективного N-алкоксиметилирования полифторалкилпиразолов под действием параформа в водно-спиртовой среде. Разработан метод введения N-рибофуранозинильного заместителя в пиразолы. Дезацилирование перацилированного сахарного остатка позволило получить неприродные нуклеозиды с пиразольным основанием в качестве агликона, которые, как нами было установлено, обладают противовирусной активностью в отношении вируса гриппа A/H1N1. Предложен подход к синтезу трифторметилсодержащего аналога фенилбутазона. Развиты подходы к химической модификации полифторсалициловых кислот, изучены их кислотные свойства и комплексообразующая способность. Установлены основные закономерности зависимости кислотности от строения салициловых кислот. Амидированием метил-полифторсалицилатов с гидроксидом аммиака синтезированы амиды полифторсалициловых кислот как аналоги препарата салициламид. Разработаны методы получения новых полифторароматических соединений на основе хлорангидридов полифторсалициловых кислот как перспективных реагентов для органического синтеза. Выполнено исследование биологических свойств синтезированных N-метилпиразолонов как аналогов антипирина и О-метоксипиразолов как аналогов целекоксиба. Теоретическая оценка фармакокинетических характеристик синтезированных соединений показала их полное соответствие правилам обнаружения лекарственных препаратов. Результаты молекулярного докинга продемонстрировали, что все исследуемые соединения способны связывать COX-1, однако по отношению к СОХ-2 они проявляют меньшую эффективность по сравнению с арахидоновой кислотой и целекоксибом. В опытах PAMPA in vitro определена способность полифторалкилсодержащих производных более эффективно проходить через искусственные биомембраны при разных pH по сравнению с антипирином. Определение ориентировочной острой токсичности синтезированных соединений на мышах CD-1 показало, что при внутрибрюшинном введении все соединения значительно менее токсичны, чем диклофенак, но некоторые из них токсичнее анальгина. Однако тестирование СF3-антипирина при пероральном введении показало значительное снижение острой токсичности. При оценке анальгетической активности синтезированных соединений in vivo в тесте «горячая пластинка» найдено, что CF3-антипирин обладает наиболее значительным анальгетическим эффектом, превышающий таковой у препарата сравнения метамизола. Метокси-CF3-пиразол также проявляет довольно сильный анальгетический эффект. Анализ «структура-активность» показал, что удлинение полифторалкильного заместителя приводит к частичной потере анальгетической активности для C2F5-антипирина. Установлено, что заместитель в арильном фрагменте пиразолов оказывает определяющее влияние на их антиноцицептивные свойства. Анальгезирующее действие CF3-антипирина дополнительно оценено в тесте «tail-flick» и на модели гиперальгезии, индуцированной воспалением. Первичная оценка противовоспалительной активности синтезированных соединений на модели каррагинанового отека показала ярко выраженное противовоспалительное действие CF3-антипирина. Найдено, что CF3-антипирин значительно снижает ректальную температуру крыс по сравнению с парацетамолом. Оценка влияния CF3-антипирина на поведенческие реакции животных в тесте in vivo «открытое поле» показала, что он не влияет на анализируемую двигательную активность, состояние тревоги и исследовательское поведение мышей. В результате исследований установлено, что CF3-антипирин проявляет противовоспалительную и анальгетическую активности на уровне или значительно выше, чем у диклофенака и метамизола, а жаропонижающее действие выше, чем у парацетамола.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Данные по оценке анальгезирующего действия 3-трифторметилпиразол-5-ола и его алкилированных производных в тесте in vivo “горячая пластина” свидетельствуют о перспективности поиска новых анальгетических средств среди полифторалкилсодержащих пиразолов, поскольку большинство протестированных соединений проявили выраженное антиноцицептивное действие, при этом биологическая активность не коррелирует с токсичностью, а произведенные структурные изменения позволяют спланировать дальнейшую оптимизацию молекулы. Установлено, что О-алкилирование 1-арил-3-полифторалкилпиразол-5-олов является перспективным путем получения соединений с высокой анальгетической активностью и низкой токсичностью. Для синтеза 5-алкоксизамещенных производных использованы реакции хемоселективного алкоксилирования в присутствии неорганического основания, тогда как О-арилирование реализуется только в каталитических условиях реакции Бухвальда-Хартвига. При изучении антиоксидантной и мембраностабилизирующей активности этой группы соединений в тестах АОА с AAPH и МСА с AAPH найдено, что пиразолы, имеющие НО- или NН-группы, обладают радикал-связывающей или прооксидантной активностью, а также мембранозащитным действием в исследованных концентрациях. Найдены условия для селективного О-метилирования 4-арилгидразоно-3-полифторалкилпиразол-5-олов, позволившие получить их О-метилированные производные. При этом установлено, что метилирование пиразолов предпочтительно реализуется по О-центру, несмотря на существование их в виде пиразол-5-онов. Разработаны эффективные методы получения 4-гидроксиимино-3-полифторалкилпиразол-2-онов, установлено их таутомерное строение, а также исследованы их биологические свойства. Для введения гидроксииминного заместителя опробовано три подхода, из которых наиболее перспективным оказался однореакторный метод, заключающийся в получении пиразолов in situ из 3-оксоэфиров и гидразинов в уксусной кислоте и последующей обработке реакционной массы нитритом натрия. Методами ИК, ЯМР спектроскопии и РСА установлено, что продукты нитрозирования 3-полифторалкилпиразол-5-олов в кристаллах и растворах существуют в виде смеси Z,E-изомеров 4-гидроксииминопиразол-5-онов. Показано, что результат их восстановления зависит от используемой восстановительной системы. Гидрохлориды 4-аминопиразол-5-олов получены под действием хлорида олова(II) в соляной кислоте, а свободные основания при использовании дитионита натрия. Установлено, что направление циклизации трифторметилсодержащих 2-нитрозо-1,3-дикетонов с гидразинами зависит от строения этого реагента: в реакциях с метилгидразином и 4-гидразинилфенилсульфонамидом образуются 4-нитрозо-3-трифторметилпиразолы, а с фенилгидразином и гидразидами - 5-трифторметил-5-гидроксипиразолины. Региоселективная циклизация 2-гидроксиимино- и 2-арилгидразоно-1,3-дикетонов с 4-гидразинилфенилсульфонамидом использована для синтеза 4-нитрозо- и 4-арилазо-замещенных аналогов целекоксиба. Предложены способы модификации 4-амино-3-трифторметилпиразолов, синтезированных на предыдущем этапе, по аминогруппе в реакциях с альдегидами, фенилизоцианатом и метилирования. С помощью квантово-химических расчетов с использованием подпрограммы QikProp оценены физико-химические и фармакокинетические параметры синтезированных полифторалкилсодержащих 4-гидроксиимино-, 4-нитрозо- и 4-аминопиразолов. Расчет ADME параметров показал, что все исследованные пиразолы соответствуют «правилу пяти» Липински (RO5), что позволяет рассматривать данные структуры как возможные потенциальные лекарственные соединения. Выполнено разностороннее тестирование биологических свойств 4-замещенных 3-полифторалкилпиразолов. Для ряда 4-нитрозопиразолов установлено туберкулостатическое действие на микобактерии туберкулеза H37Rv от умеренных до высоких значений (МИК от 0.36 до 12.5 мкг/мл), а также выявлена умеренная активность по отношению к Streptococcus pyogenes (МИК 7.8 мг/мл), Neisseria gonorrhoeae и Staphylococcus aureus (МИК 15.6 мг/мл). При тестировании антимикотической активности обнаружено, что наибольшей активностью обладает 1-метил-4-нитрозо-5-фенилпиразол по отношению к Epidermophyton floccosum (МИК 0.38 мг/мл), к Trichophyton tonsurans (МИК 3.12 мг/мл), к Trichophyton schoenleinii и Trichophiton violaceum (МИК 6.25 мг/мл). При исследовании анальгетического действия в тесте «горячая пластина» в дозе 15 мг/кг 4-гидроксииминопиразол-5-оны и 4-нитрозопиразолы показали увеличение латентного периода до 35…80%, а 4-аминопиразолы - до 90…100%, что сравнимо с действием препаратов диклофенак и анальгин в сопоставимых дозах. Найдена тенденция к увеличению анальгетической активности пиразолов за счет введения нитрозо- и аминогруппы в их 4 положение. 4-Арилгидразоносодержащие 1-фенил-3-трифторметилпиразолы в точке 2 ч после введения проявляют анальгетический эффект на уровне диклофенака. Тестирование в модели каррагенинового отека на крысах SD показало небольшое противовоспалительное действие ряда соединений. При оценке антирадикальной активности в ABTS тесте установлено, что 4-нитрозопиразолы, N-замещенные 4-гидроксиимино- и 1-толилгидразонопиразол-5-оны обладают слабой способностью связывать радикалы по сравнению с Trolox, тогда как NH-незамещенные 4-гидроксииминопиразол-5-оны показали умеренную антирадикальную активность. Наиболее перспективные антирадикальные свойства в этой серии показал 1-толилгидразоно-3-трифторметилпиразол-5-он. При исследовании цитотоксической активности на первичной культуре дермальных фибробластов человека и на перевиваемой культуре клеток HeLa установлена более высокая токсичность трифторметилсодержащих 2-гидроксиимино- и 2-арилгидразонопиразол-5-онов в отношении раковых клеток линии HeLa, чем в отношении фибробластов человека. Изучение острой токсичности на мышах CD-1 показало, что 2-гидроксииминопиразол-5-оны при внутрибрюшинном введении менее токсичны (LD50 150 – 300 мг/кг и выше), чем диклофенак, причем при пероральном введении их токсичность снижается. Наблюдается общая тенденция к снижению токсичности при удлинении полифторалкильного заместителя. Большинство исследованных 4-нитрозопиразолов также проявили умеренную токсичность. N-Метилзамещенные производные оказались менее токсичные, чем их N-незамещенные аналоги. Найдено, что замена гидроксимино- и нитрозогрупп на амино-функцию в пиразолах приводит к увеличению токсичности, тогда как замена их на арилгидразоный заместитель способствует ее значительному снижению. Установлена дезактивация СН-положения полифторалкильных аналогов антипирина в реакциях нитрозирования и диазотирования за счет влияния электроноакцепторного полифторалкильного заместителя. Однако показана принципиальная возможность нитрования CF3-антипиринов с получением 4-нитропроизводных, пригодных для последующего синтеза на их основе полных структурных аналогов метамизола. Синтезированы 4-бром-3-полифторалкилпиразол-5-олы как перспективные реагенты для реакций кросс-сочетания, аминирования по Бухвальду-Хартвигу, а также как бифункциональных реагентов при формировании пиразолоконденсированных гетероциклов. Разработан подход к синтезу 6-(2-арилгидразинилиден)-5-трифторметилпиразоло[1,5-а]пиримидин-7-онов за счет региоселективной циклизации 2-арилгидразоно-3-оксоэфиров с 5-аминопиразолами. В тесте "горячая пластина" пиразолопиримидин, имеющий в положении 2 фенильный заместитель, проявил высокое анальгетическое действие. Для синтеза трифторметилсодержащих аналогов фенилбутазона предложено использовать реакции трифторметилирования и последовательного аллилирования и трифторметилирования 1,2-дифенилпиразол-3,5-диона по мезо-положению с получением 4-трифторметил- и 4-(2-йод-4,4,4-трифторбутил)замещенных производных. На данном этапе нами разработаны способы получения 4-циклоаминозамещенных полифторсалициловых кислот и изучена их наиболее вероятная биологическая активность. Их синтез основан на нуклеофильном ароматическом замещении атомов фтора в эфирах полифторсалициловых кислотах, полученных нами на первом этапе. В зависимости от условий и строения исходных реагентов из алкил-3,4,5,6-тетра-, 3,4,5-три- и 4,5-дифторсалицилатов и циклоаминов могут быть получены 4-циклоамино-3,5,6-трифтор-, -3,5-дифтор- и -5-фторсалициловые кислоты, их эфиры и амиды, ужесточение условий позволяет получить труднодоступные 3-циклоаминозамещенные полифторфенолы. Обнаружено однореакторное протекание гидролиза сложноэфирных и амидных групп полифторсалицилатов, обусловленное внутримолекулярным нуклеофильным катализом с участием соседнего гидроксильного заместителя. Расчет ADME параметров показал, что производные 4-циклоаминофторсалициловых кислот могут рассматриваться как потенциальные биологически активные соединения. При исследовании этих биологических свойств 4-циклоаминопроизводных фторсалицилатов в опытах in vivo установлено, введение фрагментов морфолина и метилпиперазина в пара-положение к карбоксильной группе приводит к значительному снижению токсичности. Большинство синтезированных соединений обладают анальгетической активностью в тесте «горячая пластинка». Показано анальгетическое действие CF3-антипирина и BuO-пиразола в тесте «горячая пластина» при пероральном введении крысам стока SD: в дозе 25 мг/кг их действие несколько сильнее эффекта диклофенака в дозе 10 мг/кг. Учитывая, что острая токсичность исследуемых пиразолов ниже токсичности диклофенака, данный результат дополнительно подтверждает перспективность выбранной стратегии. С помощью сравнительной оценки CF3-антипирина и BuO-пиразола в формалиновом тесте на мышах стока CD при внутрибрюшинном введении в дозе 15 мг/кг показана большая эффективность CF3-антипирина. Для дальнейших углубленных исследований был выбран CF3-антипирина. Его анальгетическое действие было подтверждено в тесте на распределение животными нагрузки на каждую из задних лап при индукции воспалительной реакции в одной из них. Проведена ориентировочная оценка метаболической стабильности CF3-антипирина in vitro и in vivo. Установлено, что при инкубировании с плазмой крысы или субфракцией S9 печени крысы (и НАДФ в качестве кофактора) CF3-антипирин не проявляет значительных признаков метаболической трансформации. Оценка метаболической стабильности на крысах-самцах стока SD показала, что его максимальная концентрация в плазме крови создается примерно через 30 мин после внутрибрюшинного введения. Найдено, что предполагаемым основным его метаболитом является N-деметилированное производное – 1-фенил-3-трифторметилпиразол-5-ол. Выполнена оценка токсического и местнораздражающего действия CF3-антипирина при курсовом пероральном введении в течение 10 дней. Проводили общий и биохимический анализ крови и анализ мочи животных до введения препарата и в конце курсового введения. После эвтаназии животных проводили морфологическое исследование внутренних органов, морфометрический анализ с определением относительной массы органов и гистологическое исследование. Результаты исследований позволили заключить, что введение CF3-антипирина в дозе 30 мг/кг не влияло на динамику прибавки массы тела у животных. CF3-антипирин не оказал существенного влияния на состав крови крыс; показатели общего и биохимического анализа крови животных находились в пределах физиологической нормы для этого вида животных. Анализ показателей мочи также не выявил отклонений от физиологической нормы для белых крыс. Патоморфологическое и патогистологическое исследование не обнаружило существенных изменений в изученных органах и тканях животных, получавших испытуемый препарат, по сравнению с животными контрольной группы. При гистологическом исследовании органов лабораторных животных (легкие, сердце, печень, тонкая кишка, желудок, пищевод, почки, печень) морфологических признаков токсического повреждения паренхиматозных органов и желудочно-кишечного тракта не обнаружено. Структура исследованных тканей при введении исследуемого препарата соответствует нормальной гистологической картине. Полученные результаты свидетельствуют о перспективности дальнейшего исследования этого соединения.