Аннотация результатов, полученных в 2016 году
Главной задачей в рамках трехлетнего проекта является разработка тест-систем, основанных на принципе иммунохроматографического анализа, для эффективного скрининга ключевых бактериальных, вирусных и вироидных патогенов картофеля: возбудители черной ножки и кольцевой гнили, вирус скручивания листьев картофеля, X-, Y-, M- и S-вирусы картофеля, вироид веретеновидности клубней картофеля в семенном материале картофеля. Проект основан на новых методических решениях, направленных на снижение времени анализа, предела обнаружения для фитопатогенов, включающих бактериальные, вирусные и вироидную инфекции, а также решений, позволяющих проводить комплексный анализа 10 фитопатогенов в одной пробе. Реализация подходов, предложенных в настоящем проекте, обеспечит высокий конкурентный потенциал тест-системы, возможность широкого практического применения и, благодаря этому – значительное повышение урожайности при выращивании картофеля. Работы по проекту, выполненные в 2016 г., были направлены на проведение сравнительной характеристики аффинности и специфичности иммунореагентов для иммунодетекции девяти приоритетных фитопатогенов, а также на получение конъюгатов наночастиц для специфического распознавания фитопатогенов и для амплификации сигнала в разрабатываемых системах. Отдельный блок работ был проведен по получению вироида веретеновидности клубней картофеля, для которого будут впервые получены специфические иммунореагенты и разработана иммуноаналитическая тест-система. На данном этапе осуществлена наработка вироида в препаративных количествах и характеристика чистоты полученного препарата. С помощью обратной транскрипции вироидной кДНК и полимеразной цепной реакции получено 1,3 мг РНК-транскрипта. УФ-спектрофотометрический анализ и электрофорез в агарозном геле подтвердили, что полученная РНК соответствует линейной форме вироидной РНК. Разработаны протоколы химической модификации вироидной РНК для последующей иммунизации и получения специфических антител. Все препараты антител, были охарактеризованы и сопоставлены по аффинности и специфичности. В работе использовали поликлональные и моноклональные антител. Константы взаимодействия, полученные на основании измерений поверхностного плазмонного резонанса в биосенсорной системе, для всех антител находились в диапазоне от 3.5×10(4) до 2.2×10(5) 1/Ms для кинетической константы ассоциации, от 3.7×10(-4) до 9.8×10(-4) 1/s для кинетической константы диссоциации, от 1×10(-8) до 4×10(-9) M для равновесной константы диссоциации. Таким образом, все антитела являются высокоаффинными, что обеспечит низкий предел обнаружения наряду с использованием уникальных схем усиления сигнала в иммуноанализе. Для оценки специфичности иммунореагентов и предотвращения рисков ложноположительных результатов диагностики было проведено тестирование с использованием коллекций штаммов, насчитывающих 17 изолятов, принадлежащих девяти различным бактериальным патогенам (близкородственные патогены и патогены, принадлежащих другим таксономическим группам). Проведена оценка перекрестных реакций с сапрофитными бактериями и с экстрактами здоровых растений. Тестирование проводили в форматах традиционного твердофазного прямого (с использованием модифицированных производных антител) и конкурентного иммуноферментного анализа в равновесных условиях, а также визуализировали иммунные комплексы, образуемые с вирусными и бактериальными патогенами, с использованием микроскопических техник (атомно-силовая микроскопия, просвечивающая электронная микроскопия). Высокую специфичность выбранных антител подтверждали специфические титры, более чем в 200 раз превышающие неспецифические, и низкие фоновые значения неспецифических реакций при использовании антител в иммуноферментных системах. Эффективность антител, полученных для детекции Dickeya sp., подтверждена реализацией с их использованием монопараметрической тест-системы для диагностики черной ножки картофеля, вызываемой D. dianthicola and D. solani. Для данной системы установлены следующие характеристики: визуальный предел обнаружения в листьях - 1 × 10(5) КОЕ/мл, в клубнях - 4 × 10(5) КОЕ/мл, время анализа - 10 мин. Данные по селективности антител, специфичных к D. dianthicola и D. solani вошли в состав статьи (Safenkova et al. «Development of a lateral flow immunoassay for rapid diagnosis of potato blackleg caused by Dickeya species»), принятой к публикации в журнал Analytical and Bioanalytical Chemistry (doi: 10.1007/s00216-016-0140-6). С целью последующего использования в разрабатываемых иммуноаналитических системах выбранные препараты антител были модифицированы, что включало их биотинилирование и введение линкерных структур с концевыми амино- или карбоксигруппами, получение Fab фрагментов. Конъюгаты антител с коллоидным золотом (КЗ) и магнитными наночастицами (МНЧ) были получены тремя способами: методом физико-химической адсорбции биомолекул на поверхности наночастиц; методом ковалентной направленной иммобилизации биомолекул на поверхности наночастиц; методом нековалентной направленной иммобилизации биомолекул на поверхности коллоидного золота с использованием пары биотин-стрептавидин. Получены серии конъюгатов КЗ с антителами (моноспецифичный конъюгат), с биотинилированными антителами (моноспецифичный конъюгат с возможностью амплификации), с несколькими антителами (мультиспецифичный конъюгат), со стрептавидином (конъюгат для направленной иммобилизации биотинилированных антител), с белком А (конъюгат для направленной иммобилизации не биотинилированных антител). Характеристика наночастиц и их конъюгатов проводилась с использованием комплекса методов, включающих электронную и атомно-силовую микроскопию, регистрацию динамического светорассеяния, благодаря чему получены достоверные данные о размерах, сорбционной емкости и микрогетерогенности носителей-маркеров. Для наночастиц КЗ, обладающих меньшими размерами (3 препарата со средними диаметрами 15, 24 и 35 нм), отмечена большая гомогенность и наночастиц, и конъюгатов с антителами, полученными на их основе (СV ≤15%). Для препаратов на основе МНЧ с гидродинамический диаметром 566 ± 174 нм и индекс полидисперсности – 0,148 наблюдалась большая гетерогенность. Для синтезированных конъюгатов с МНЧ с антителами гидродинамический диаметр составил 615±134 нм, индекс полидисперсности – 0,078; конъюгатов МНЧ с биотинилированными антителами – 626 ± 105 нм, индекс полидисперсности – 0,074; конъюгатов МНЧ со стрептавидин – пероксидазой – 671 ± 147 нм, индекс полидисперсности – 0,088. Для всех синтезированных препаратов показана высокая стабильность и сохранение оптических (по результатам спектрофотометрического анализа) и антиген-связывающих свойств (по результатам иммуноферментного и иммунохроматографического сравнения) после длительного хранения (от 1 до 12 недель). Таким образом, сформирован пул реагентов для специфического распознавания фитопатогенов и для амплификации сигнала в аналитических зонах разрабатываемых тест-систем. Проведенная экспериментальная характеристика полученных реагентов подтвердила возможность их применения в иммунохроматографическом анализе. Параллельно с работами по характеристике иммунореагентов была сформирована панель биопроб для лабораторной характеристики прототипных тест-систем. Пораженность вирусными фитопатогенами биопроб, полученных из растений-накопителей (картофель, томат, табак), специально зараженных очищенными препаратами вирусов, была подтверждена в 100% случаев методом ИФА. Показано, что каждая биопроба содержит один вид вирусного фитопатогена, смешанные инфекции не были обнаружены. Экстракты, полученные из партий семенного картофеля (двадцать семь объединенных партий семенного картофеля из различных регионов Российской Федерации) предварительно тестировали методом полимеразной цепной реакции в реальном времени и ИФА. В результате показано присутствие бактериальных патогенов (C. michiganensis subsp. sepedonicus, P. atrosepticum, Dickeya species) в части биопроб. Данные по содержанию в пробах Dickeya species будут опубликованы в статье, принятой в печать (Safenkova et al. Anal. Bioanal. Chem. doi: 10.1007/s00216-016-0140-6). Таким образом, сформированная панель биопроб может быть использована для первичной апробации разрабатываемых тест-систем. Результаты, полученные в ходе выполнения проекта в 2016 г., позволяют выбрать наиболее перспективные иммунореагенты для применения в разрабатываемых иммунохроматографических системах и перейти к следующему этапу по включению полученных иммунореагентов в схемы амплификации для высокочувствительного мультипараметрического анализа.

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Работы по проекту, выполненные в 2017 г., были направлены на выбор наиболее эффективной схемы для мультипараметрического формата иммунохроматографического анализа патогенов картофеля, а также выбор протоколов амплификации для повышения чувствительности анализа. Для решения этих задач специфические реагенты, полученные и охарактеризованные на первом этапе работ, были использованы для получения двух типов мультипараметрических иммунохроматографических тест-систем: 1) тест-системы с использованием смешанных конъюгатов и 2) тест-системы в мультизонном варианте. Оба типа тест-систем решают задачи интегрального контроля нескольких патогенов в рамках одного анализа. Для выявления общей зараженности без дифференцировки конкретных возбудителей синтезировали конъюгат, способный связываться с каждым из определяемых патогенов благодаря иммобилизации на поверхности наночастиц золота (НЧЗ) антител разной специфичности (мультиспецифичный конъюгат). На основе мультиспецифичного конъюгата была впервые получена иммунохроматографическая тест-система, обладающая специфичностью к нескольким неродственным патогенам (X-, Y(N)-, Y(O)-, S-, M- вирусам картофеля и вирусу скручивания листьев картофеля). Сравнительная характеристика тест-систем показала, что пределы обнаружения патогенов не изменились при переходе на мультиспецифичный конъюгат и соответствовали 10-50 нг/мл (в зависимости от патогена) или 50-250 нг на 1 г листьев картофеля. Формирование комплексов конъюгат – патоген и их концентрирование в аналитической зоне происходит в присутствии как одного фитопатогена из определяемой группы, так и нескольких фитопатогенов. Для идентификации возбудителей инфекции предложена схема мультизонной иммунохроматографической тест-системы, распознающей и дифференцирующей 10 патогенов одновременно (Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus, Pectobacterium atrosepticum, P. carotovorum subsp. сarotovorum и Dickeya subsp., X-, Y(N)-, Y(O)-, S-, M- вирусы картофеля и вирус скручивания листьев картофеля). В результате оптимизации выбраны параметры, обеспечивающие максимальную чувствительность и достоверность анализа: объем раствора при нанесении одной аналитической зоны (40-50 мкл), расстояние между аналитическими зонами (1 мм), минимальное расстояние от мембраны с конъюгатом (1,5 мм), количество рядов точек (10 аналитических рядов точек, каждая из которых содержит антитела, специфичные к одному из фитопатогенов, и 1 контрольный ряд точек с антивидовыми антителами), нитроцеллюлозная мембрана CNPC-10μ или CNPC-12μ («Advanced Microdevices», Индия), оптическая плотность конъюгатов (OD520 = 10 для каждого конъюгата). С одной стороны, выбранная геометрия не ограничивает формирование иммунных комплексов как при низкой, так и при высокой скорости ассоциации. С другой стороны, размер формируемой аналитической зоны не блокирует продвижение иммунных комплексов вместе с фронтом жидкости к расположенным выше аналитическим рядам. В результате для каждого из патогенов достигнут предел обнаружения, соответствующий ГОСТ Р 55329-2012 (10-50 нг/мл для вирусов и 10(4)-10(5) кл./мл для бактериальных патогенов). Для решения задач высокочувствительной диагностики исследованы три основных направления амплификации в иммунохроматографии: (1) агрегация наночастиц, 2) ферментное усиление сигнала, 3) модификация метки в аналитической зоне – метод серебряного усиления. Применение подхода (1) показало, что одновременное использование конъюгата магнитных наночастиц (МНЧ) и золотых наночастиц в ИХА позволяет снизить предел обнаружения в 32 раза по сравнению с традиционным ИХА. Эффект основан на магнитном концентрировании и образовании гетероагрегатов между конъюгатом МНЧ – специфические антитела и конъюгатом НЧЗ – стрептавидин. Подход (2) основан на накоплении большого количества детектируемой метки, которая является продуктом ферментативной реакции. Амплификация была реализована при использовании пероксидазы хрена (ПХ) и щелочной фосфатазы (ЩФ). Наилучший результат получен для системы с двумя конъюгатами: НЧЗ – ЩФ – антивидовые IgG и НЧЗ – специфические антитела, взаимодействующими друг с другом в процессе формирования иммунных комплексов, детектируемых в аналитической зоне. Увеличение сигнала составляло от 30 до 400%. Предел обнаружения ИХА после добавления субстратной смеси BCIP/NBT был в 27 раз ниже по сравнению с традиционным ИХА без усиления. Подход (3) основан на восстановлении лактата серебра гидрохиноном, катализируемой наночастицами золота, входящими в состав конъюгатов со специфическими антителами. В результате реакции восстановления вокруг НЧЗ формируются крупные, ярко окрашенные частицы серебра, что приводит к значительному увеличению окрашивания аналитической зоны. Данный подход позволил снизить предел обнаружения в 15 раз по сравнению с традиционным ИХА без усиления. Предложено оригинальное решение по использованию стоп-реагента, прекращающего восстановление ионов серебра на поверхности НЧЗ и предотвращающего неспецифическое окрашивание, появление ложноположительных результатов. Время анализа, включая амплификацию, – 15 минут. Все три подхода по амплификации ИХА обеспечили снижение минимальных определяемых концентраций более чем в 10 раз. С учетом простоты реализации, отсутствия дополнительных компонентов и универсальности применения для мультипараметрической амплификации выбрана амплификации, основанная на серебряном усилении. При использовании серебряного усиления для мультипараметрической тест-системы получено усиление от 10 до 60 раз в зависимости от фитопатогена. Продолжены работы по получению реагентов для иммунодетекции вироида веретеновидности клубней картофеля (ВВКК). Синтезированы модифицированные препараты транскрипта ВВКК для иммунизации – транскрипт с диенплатиновой модификацией и транскрипт, ковалентно присоединенный к лизоциму. На основе обоих иммуногенов получены мышиные и кроличьи антисыворотки. Результаты дот-иммуноанализов показали, что антисыворотки животных, иммунизированных вироидной РНК, содержат антитела, специфичные к транскрипту ВВКК, специфично распознают природный ВВКК. Помимо этого, в препарате сывороток к транскрипту есть антитела, дающие кросс-реакцию с клеточной РНК. Из наиболее аффинных иммунных антисывороток кролика и из соответствующих преиммунных сывороток выделяли иммуноглобулины G осаждением сульфатом аммония. В сэндвич-формате иммуноферментного анализа показано, что полученные антитела распознают ВВКК в концентрации до 50 нг/мл (транскрипт ВВКК), однако наблюдаются неспецифические реакции при добавлении суммарной РНК незараженного растения. Для разработки протоколов пробоотбора и пробоподготовки биопроб для ИХА были использованы здоровые и пораженные листья картофеля. Поражение материала было подтверждено методом ИФА во ВНИИ картофельного хозяйства им. Лорха (Красково, Московская область). Для пробоподготовки использовали два основных протокола. Первый обеспечивает лабораторную диагностику. Для его реализации навеску листьев измельчали в экстрагирующем буфере до получения грубодисперсной суспензии в массовом соотношении 1:10. Для получения искусственно контаминированных образцов в экстракты из здоровых листьев вносили известное количество одного из целевых фитопатогенов или их смесь (для мультипараметрических тест-систем). Второй протокол – для полевого анализа. Его особенностью стала адаптация, минимизация и упрощение всех этапов пробоподготовки для бесприборной реализации. Адаптированная комплектация тест-системы включала одноразовые устройства (пакетик с экстрагирующим буфером, одноразовые пипетки), вспомогательные устройства (магнит), аликвоты амплифицирующих реагентов. Особое внимание было уделено пробоподготовке для тест-систем с амплификацией, включающей дополнительные манипуляции с магнитным концентрированием, отмывкой или добавлением субстратных смесей. Подтверждена применимость обоих протоколов для мультипараметрического анализа растительного материала без снижения чувствительности относительно гомогенных антигенных препаратов. Таким образом, результаты, полученные в 2017 г., позволяют выбрать наиболее перспективные протоколы и схемы амплификации для применения в мультипараметрической детекции патогенов картофеля. Тест-системы, изготовленные согласно выбранным схемам и протоколам, будут подробно охарактеризованы и пройдут апробацию на заключительном этапе проекта. В 2017 г. 2 статьи опубликованы в журналах (Microchimica Acta, Food and Agricultural Immunology), 1 статья находится на рассмотрении (Analytica Chimica Acta), 1 статья подготовлена к подаче в редакцию (Chemical Communications).

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Работы, выполненные на заключительном этапе проекта в 2018 г., были направлены на детальную экспериментальную характеристику тест-систем для мультиплексной диагностики приоритетных вирусных и бактериальных заболеваний картофеля, включающих средства предварительного скринингового и подтверждающего тестирования. Для решения этих задач были получены серии иммунохроматографических тест-систем: 1) тест-системы для определения общей зараженности картофеля с использованием универсального мультиспецифичного конъюгата (скрининговый тест), 2) тест-системы для одновременной детекции и идентификации до 10 патогенов в пробе с высокой чувствительностью благодаря, достигаемой благодаря амплификации сигнала (подтверждающий тест). Оба формата тест-систем имеют открытую конфигурацию, что позволяет включать в перечень диагностируемых объектов различные значимые патогены картофеля (возбудители черной ножки и кольцевой гнили (Pectobacterium atrosepticum, P. carotovorum subsp. сarotovorum, Dickeya spp., Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus, вирусы скручивания листьев картофеля (ВСЛК), X-, Y-, M- и S-вирусы картофеля (ХВК, YВК, MВК, SВК), вироид веретеновидности листьев картофеля (ВВКК)), а также обеспечивает основу для включения в анализ других картофельных патогенов. Для скринингового иммунохроматографического анализа (ИХА) была установлена оптимальная комплектация, включающая мультиспецифичный конъюгат смеси антител разной специфичности и золотых наночастиц. Показано, что при комплектации скринингового теста для определения общей зараженности, обусловленной пятью патогенами, аналитические характеристики сопоставимы с монопараметрическими тест-системами. При этом производительность анализа выше благодаря одновременному выявлению пяти патогенов в одной пробе. В качестве основных объектов, для которых был реализован скрининговый ИХА, выбрали вирусные патогены: ХВК, YВК, MВК, SВК, ВСЛК. Установлены следующие пределы обнаружения: 10 нг/мл для XВК, 20 нг/мл для YВК и MВК, 30 нг/мл для ВСЛК и SВК. Компоненты растительного матрикса не оказывают влияния на характеристики анализа. Показано отсутствие ложно положительных и отрицательных результатов. Данный подход может использован для массового тестирования фитопатогенов в условиях ограниченного времени (например, таможенный фитосанитарный контроль). Для анализа не требуется дополнительного оборудования и реагентов. Продолжительность тестирования составляет 10 мин. Предложенный формат тест-системы значительно упрощает рутинный скрининг основных вирусов картофеля и повышает его производительность. Для подтверждающей мультизонной иммунохроматографической тест-системы в рамках проекта стояла задача обеспечить низкие пределы обнаружения (≤ 10(4) кл./мл – для бактерий, ≤ 10 нг/мл – для вирусов, ≤ 10 нг/мл – для вироида), сохраняя продолжительность тестирования до 30 минут. Проведённые на предыдущем этапе исследования позволили выбрать условия изготовления тест-полосок, проведения анализа и способ амплификации, обеспечивающие наименьший предел обнаружения и высокую достоверность диагностики. За весь период выполнения проекта предложено и охарактеризовано четыре типа амплификационных решений: 1) одновременное использование конъюгата магнитных наночастиц (МНЧ) и золотых наночастиц (НЧЗ) – агрегация наночастиц, 2) ферментное усиление сигнала благодаря использованию дополнительного конъюгата с щелочной фосфатазой, 3) модификация метки в тестовой зоне восстановлением ионов серебра на поверхности НЧЗ – метод серебряного усиления, 4) модификация метки в тестовой зоне восстановлением ионов золота на поверхности НЧЗ – метод золотого усиления. Из всех разработанных нами подходов наиболее простым является серебряное усиление. Золотое усиление обеспечивает значительное увеличение интенсивности окрашивания, однако из-за высокой оптической плотности смеси конъюгатов, характерной для мультиплексной тест-системы, применение данного методического подхода ограничивается возможным фоновым окрашиванием. Серебряное усиление не требует введения в систему дополнительных реагентов (ферментных меток, конъюгатов со стрептавидином). Таким образом, несмотря на необходимость отмывки тест-полосок, данный подход оптимален для подтверждающего теста. Использование серебряного усиления для подтверждающего мультиплексного анализа позволило снизить пределы обнаружения вирусов до 16 раз по сравнению с мультизонным тестом без усиления (пределы обнаружения ХВК и ВСЛК- 2 нг/мл, МВК, SВК, Y(N)ВК – 4 нг/мл, Y(O)ВК – 8 нг/мл) и бактерий до 10 раз (P. carotovorum и Dickeya spp – 104 клеток/мл, P. atrosepticum – 10(4) клеток/мл, C. michiganensis – 10(3) клеток/мл). Разработанный подтверждающий тест позволяет выявлять и дифференцировать до десяти патогенов вирусной и бактериальной природы в одном образце. Для характеристики иммунохимического определения вироида веретеновидности клубней картофеля (ВВКК) in vitro, что является отдельной нетривиальной задачей в рамках проекта, собирали несколько вариантов иммунохроматографических тест-систем с нитроцеллюлозной рабочей мембраной CNPF-SN12 (10 µ), на которой формировали зоны связывания двух видов: точки и линии. В тестовых зонах связывания иммобилизовали антитела, полученные при иммунизации конъюгатом вироидная РНК-лизоцим. Контрольную зону формировали, иммобилизуя антитела, специфичные к мышиным иммуноглобулинам G. Для детекции иммунных комплексов синтезировали конъюгаты НЧЗ (диаметр 25 нм) с антителами, полученными при иммунизации конъюгатом вироидная РНК-лизоцим. В результате оптимизации условий для иммунохроматографического определения ВВКК предложено: 1) проведение анализа в буфере с высокой ионной силой (15 мМ фосфатный буфер, содержащий 300 мМ NaCl), 2) проведение предварительной инкубации антител с тотальным препаратом дрожжевой РНК для исключения неспецифических реакций. Предложенная иммунохроматографическая тест-система показала эффективное обнаружение ВВКК при низких концентрациях РНК и больших разведениях экстракта. Полученная зависимость интенсивности окраски тестовой зоны от концентрации ВВКК имеет линейный диапазон в интервале от 20 до 500 нг/мл, предел обнаружения – 10 нг/мл. Отметим, что для анализа проб картофеля наилучший результат достигается при включении дополнительной стадии обогащения ВВКК посредством предварительной экстракции суммарной РНК (или ее низкомолекулярной составляющей) и концентрирования спиртом. Для достоверного документирования результатов экспрессного анализа и максимально информативной обработки полученных данных (количественное определение содержания фитопатогенов) использовали видеоцифровую измерительную технику, что обеспечивает возможность работы не с интегральной характеристикой яркости полосы в анализируемой зоне, а со всем массивом информации о распределении окраски. Для этой цели применяли портативный детектор отечественного производства – анализатор «Рефлеком» с программным обеспечением «Видеотест». Портативный прибор попиксельно регистрировал каждую зону связывания. Этот подход применяли для иммунохроматографических тест-систем без амплификации сигнала и с амплификацией. Для разных вариантов амплификации сигнала, используемых в проекте, цвет тестовой зоны изменялся от красного (маркер – наночастицы золота без усиления или усиление как следствие агрегационных взаимодействий) до синего (ферментное усиление, золотое усиление) и коричнево-черного (серебряное усиление, усиление с использованием магнитных наночастиц). Портативный детектор достоверно регистрировал сигнал на мембранах при любом цвете тестовой зоны. Для тест-систем с усилением регистрацию проводили сразу после прохождения реакции, не дожидаясь высыхания. Для сравнения использовали систему регистрации, сочетающую сканирование и последующую обработку в программе «TotalLab», версия 2.01 («Nonlinear Dynamics», Великобритания). Этот способ удобен для одновременной обработки большого массива тест-систем в лабораторных условиях. На стадии разработки иммунохроматографических систем и амплификационных подходов использовался этот тип регистрации. Портативный детектор обеспечивает предел обнаружения на порядок ниже, чем визуальная оценка благодаря достоверной регистрации слабоокрашенных тестовых зон, наблюдаемых при очень низких концентрациях патогенов: ≤ 10(3) кл./мл для бактерий, ≤ 1 нг/мл для вирусов. В рамках работ 2017-2018 гг. изучали стабильность тест-систем при хранении. Хранение тест-полосок при комнатной температуре в течение 360 дней не оказывает влияния на интенсивность окрашивания тестовой зоны, а также на чувствительность разработанных тест-систем. Хранение не влияет ни на величину неспецифичного окрашивания (для отрицательных контролей фон не детектируется), ни на степень вымывания конъюгата со стекловолоконной мембраны. Также показано, что для увеличения стабильности компонентов для проведения серебряного усиления оптимально использование навесок лактата серебра и гидрохинона. Приготовление растворов и их смешивание проводится непосредственно перед проведением усиления. Предложенный протокол серебряного усиления ИХА решает проблемы, связанные с низкой стабильностью исходных компонентов и позволяет использовать данный подход для внелабораторной диагностики. Разработанные тест-системы для скринингового и подтверждающего анализа не имеют литературных и коммерческих аналогов. Поэтому для сопоставления были выбраны монопараметрические иммунохроматографические тест-системы отечественного и зарубежного (Bioreba AG, Швейцария) производства. Сравнение показало следующие результаты: 1) скрининговая тест-система и мультизонная тест-система без амплификации сигнала, идентифицирующая до 10 патогенов в пробе, не уступают по чувствительности коммерческим монопараметрическим тест-системам; 2) мультизонная тест-система с амплификацией сигнала на 1-2 порядка (в зависимости от патогена) чувствительнее, чем коммерческие монопараметрические тест-системы; 3) время анализа для скрининговой и мультизонной тест-систем без амплификации сигнала равно 10 минутам, что соответствует времени анализа коммерческих тест-систем; 4) время анализа для мультизонной тест-системы с амплификацией больше, чем для коммерческих тест-систем – при самом быстром способе амплификации – 13 минут (золотое усиление), при самом длительном способе– 30 минут (агрегация функционализированных магнитных наночастиц и золотых наночастиц); 5) производительность скрининговой тест-системы в 5 раз выше, чем коммерческих тест-систем; 6) производительность мультизонной тест-системы в 8-10 раз выше, чем коммерческих тест-систем; 7) эффективность диагностики (достоверность получаемых положительных и отрицательных результатов) в полевых условиях с использованием разработанных тест-систем не хуже, чем для коммерческих. Таким образом, разработанные тест-системы обладают рядом конкурентных преимуществ относительно коммерческих монопараметрических тест-систем и представляются востребованными в качестве серийно производимых изделий. Внедрение новых средств производительного тестирования в массовую практику повысит эффективность диагностики инфекций и, благодаря этому – приведет к снижению потерь выращиваемого картофеля. В рамках проекта проведено обсуждение с потенциальным производителем тест-систем (ООО «РЭД», http://red-test.ru/) планов организации серийного производства. Эффективность разработанных тест-систем подтверждали на репрезентативных массивах партий семенного картофеля. Для этого совместно с ВНИИ Картофельного хозяйства им. А.Г. Лорха (Московская обл., п. Красково) были отобраны партии семенного картофеля из разных регионов РФ, представленные наиболее распространенными сортами семенного картофеля. В зависимости от категории семенного картофеля и организации-поставщика в партию входило от 1 до 200 клубней. Для оценки эффективности тест-систем при анализе надземных частей картофеля собирали коллекцию листьев в полевой вегетационный сезон. Партии визуально оценивали, отмечали наличие симптомов инфекции, проводили иммуноферментный анализ на основные вирусные и бактериальные патогены картофеля. Помимо этого, использовали искусственно зараженные растения и пробирочные растения, свободные от инфекций. В результате сбора клубневого и листового материала картофеля была сформирована репрезентативная панель проб (120 клубневых, 170 листовых), для которой методом иммуноферментного анализа показано присутствие вирусных и бактериальных инфекций, детектируемых в рамках проекта. Для скрининговой тест-системы как качественного метода анализа определена достоверность в пределах от 95 до 100% при сравнении с результатами иммуноферментного анализа. Эти результаты подтверждают, что скрининговый иммунохроматографический тест для определения общей зараженности может использоваться как простой, быстрый (10 минут) и эффективный метод обнаружения болезней картофеля без дифференциации. Для разработанных иммунохроматографических тест-систем, идентифицирующих конкретный патоген с высокой чувствительностью благодаря амплификации, было определено большее количество зараженных образцов, чем указано при паспортизации методом иммуноферментного анализа (53 образца). Эти результаты дополнительно верифицировали методом полимеразной цепной реакции, подтвердившей наличие патогенов в пробе. Достоверность результатов находилась в пределах от 95 до 100%. Результаты, полученные в 2018 г., позволяют заключить, что разработанные в рамках проекта тест-системы для предварительного скринингового и подтверждающего тестирования являются перспективным инструментом диагностики приоритетных вирусных и бактериальных заболеваний картофеля. В 2018 г. 6 статей опубликовано/принято к публикации в журналах, индексируемых в базах данных Web of Science и Scopus (Analytica Chimica Acta, Microchimica Acta, Talanta, Sensors, Российские нанотехнологии); кроме того, вышло 5 публикаций в изданиях, индексируемых РИНЦ. Подана заявка на полезную модель «Иммунохроматографическая тест-система для определения общей вирусной зараженности картофеля, вызванной пятью патогенами». Проведена очная научно-практическая конференция «Нормативное регулирование и современные методы диагностики патогенов в семеноводстве картофеля» при участии более 60 представителей научно-исследовательских и производственных организаций – руководители фирм по производству семенного картофеля, специалисты по выращиванию и хранению картофеля, селекционеры, научные сотрудники.