Аннотация результатов, полученных в 2016 году
В течение первого года работы по проекту были достигнуты следующие результаты: А) При помощи программы Oligo 6 и баз данных GenBank и BLAST были подобраны уникальные праймеры для диагностики методом ПЦР или ОТ-ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией следующих патогенов: 1) Золотистая нематода Globodera rostochiensis Прямой праймер: GCGCAGATATGCTAACATG Обратный: GGCACGGGTCCTAACAC Зонд: [FAM]CAGACATGCCGCAAGGTACG[BHQ1] 2) Некротическая форма вируса Y картофеля (PVYntn) Прямой: TGGCAACTTACACATCAACA Обратный : CGCAATCTGGACATCAGT Зонд: [ROX] CATCTCCAAACTTGCGAAGGG [BHQ2] 3) Вироид веретеновидности клубней (PSTVd) Прямой: GGTTCACACCTGACCTCC Обратный: CTTCAGTTGTTTCCACCG Зонд: [FAM]AGTAGCCGAAGCGACAGCG[BHQ1] 4) Вирус S картофеля (PVS) Прямой: CGAACACCGAGCAAATG Обратный : GAACTCCACGGTCCCAG Зонд: [FAM]TCCCTACTGAACACGTTGCTG [BHQ1] Б) Для всех перечисленных выше тест-систем выполнена оптимизация состава амплификационной смеси и подтверждена возможность применения в универсальном режиме амплификации, т.е. возможность их одновременного использования на одной и той же матрице. В) Для всех перечисленных выше тест-систем была проведена лабораторная проверка специфичности детекции с использованием референтных образцов и оценка предела аналитической чувствительности метода. Полученные результаты подтвердили высокую специфичность используемых праймеров, позволяющую уверенно диагностировать присутствие целевой ДНК или РНК в присутствии генетического материала фитопатогенных микроорганизмов той же группы, а также ДНК растения-хозяина (картофеля). Проведенные испытания показали, что для всех перечисленных выше тест-систем концентрационный предел обнаружения целевой ДНК в пробе составляет 1 нг ДНК(РНК)/мл. Г) Выполнена сравнительная оценка аналитической чувствительности диагностических тест-систем для обнаружения вирусных и вироидных патогенов картофеля при переходе с 30-луночного на 48-луночный формат qPCR-матриц. Показано, что связанное с таким переходом уменьшение объема реакционной смеси до 1 мкл не привело к ухудшению аналитической чувствительности систем.

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
В отчетном году была создана универсальная диагностическая тест-система для выявления вируса картофеля S, способная обнаруживать различные региональные вариации патогена и характеризующаяся высокой чувствительностью и отсутствием кросс-реакций на другие вирусы. Данная тест-система, наряду с разработанными ранее тест-системами для диагностики других экономических значимых вирусных и вироидных патогенов картофеля – вирусов картофеля Y (ординарная и некротическая формы), М, А, Х, вируса скручивания листьев картофеля PLRV, вируса метельчатости верхушки картофеля PMTV и вироида веретеновидности клубней PSTVd - была использована для формирования qPCR-матрицы, обеспечивающей одновременный анализ двух образцов на присутствие 8 вышеперечисленных патогенов. После определения оптимального протокола анализа, были выполнены лабораторные и полевые испытания созданной матрицы, подтвердившие высокую чувствительность тест-систем (0.1-1 нг/мл), отсутствие кросс-реакций и отличную воспроизводимость результатов. Срок хранения предподготовленных матриц при комнатной температуре в сухом помещении и в отсутствие прямого солнечного света составляет 3 мес. без потери в качестве анализа. Совместно с ФГБУ «Россельхозцентр» была выполнена успешная апробация матрицы для целей широкомасштабного скрининга вирусных/вироидных болезней картофеля в 11 регионах РФ. Разработанные тест-системы для диагностики возбудителей бактериальных болезней картофеля – Dickeya solani, D. dianthicola, P. atrosepticum и Ralstonia solanacearum – а также созданные ранее тест-системы для выявления фитопатогенных бактерий Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum, Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus и оомицета Phytophthora infestans были использованы для создания qPCR-матрицы, обеспечивающей одновременный анализ трех образцов на присутствие 7 вышеперечисленных патогенов. После определения оптимального протокола анализа, были выполнены лабораторные и полевые испытания созданной матрицы, подтвердившие высокую чувствительность тест-систем (1 нг/мл), отсутствие кросс-реакций и высокую воспроизводимость результатов. Срок хранения предподготовленных матриц при комнатной температуре в сухом помещении и в отсутствие прямого солнечного света составляет 6 мес. без потери в качестве анализа. Совместно с ФГБУ «Россельхозцентр» была выполнена успешная апробация матрицы для целей широкомасштабного скрининга бактериальных болезней и фитофтороза картофеля в 10 регионах РФ. По запросу ФГБУ «Россельхозцентр», являющегося одним из потенциальных потребителей разрабатываемых ПЦР-матриц, была дополнительно разработана тест-система для детекции всех форм вируса Y, предназначенная для количественного определения степени зараженности партий семенного картофеля данным вирусом. Дизайн матрицы позволяет проверять до 23 образцов одновременно. Был подобран оптимальный протокол амплификации. Лабораторные испытания продемонстрировали высокую чувствительность тест-системы в отношении всех форм PVY (0.1 нг/мл), отсутствие кросс-реакций на другие вирусы картофеля и высокую воспроизводимость результатов. Срок хранения предподготовленных матриц при комнатной температуре в сухом помещении и в отсутствие прямого солнечного света составдяет 3 мес. Полевые испытания, проведенные на базе Ленинградского филиала ФГБУ «Россельхозцентр» подтвердили потенциал применения данной матрицы для диагностики вируса картофеля Y. В сотрудничестве с ФГБУ «Россельхозцентр» был выполнен широкомасштабный скрининг вирусных/вироидных и бактериальных/оомицетных патогенов картофеля в 11 и 10 регионах РФ, соответственно. Впервые были получены данные по присутствию и частоте встречаемости сразу 15 патогенов картофеля в 11 регионах РФ. С учетом охвата исследованных регионов и количества одновременно проанализированных патогенов, полученные данные не имеют мировых аналогов и обладают высокой научной значимостью. Полученные результаты обеспечили детальную информацию о географической распространенности целевых патогенов и фитосанитарной ситуации в исследованных регионах. В отношении большинства целевых патогенов информация такого рода в РФ в последние годы просто отсутствует, или является неполной или нерепрезентативной. Впервые получены данные о частоте смешанных вирусных инфекций и их составе, что связано с уникальными возможностями используемого матричного подхода для диагностики. Полученная информация является уникальной и не имеет сравнимых аналогов в мире. Результаты проведенного скрининга обеспечивают возможность сравнения изученных регионов по уровню представленности различных болезней картофеля и позволяют сделать выводы о географической распространенности патогенов картофеля, а также присутствии смешанных инфекций. Выполненное исследование успешно продемонстрировало возможности и преимущества разработанных ПЦР-матриц для широкомасштабного скрининга, а в дальнейшем и мониторинга вирусных и бактериальных заболеваний картофеля с использованием стандартизированной методики анализа, доступной для персонала с невысоким уровнем квалификации. Начаты работы по созданию набора тест-систем для выявления наиболее значимых грибных патогенов картофеля и формирования соответствующей диагностической qPCR-матрицы. Разработаны тест-системы для обнаружения и идентификации возбудителей порошистой парши картофеля (Spongospora subterranean), альтернариоза картофеля и томатов (Alternaria solani и A. alternata), ризоктониоза картофеля (Rhizoctonia solani) и начата работа над тест-системой для обнаружения возбудителей фузариозной гнили картофеля (Fusarium sp.). Проведены испытания первых четырех упомянутых тест-систем на чистых культурах патогенов и полевых образцах, в том числе в матричном формате, показана хорошая воспроизводимость метода и соответствие полученных результатов параллельному анализу методом микроскопического исследования образцов. Показана возможность их практического использования в текущем виде, однако необходима некоторая методическая доработка с целью повышения чувствительности и специфичности анализа. Начаты работы по созданию тест-систем для выявления экономически значимой для картофелеводства стеблевой нематоды Ditylenchus destructor, а также родственных встречающихся на картофеле видов D. dipsaci и D. weicheri. Показана удовлетворительная эффективность и специфичность, а также отсутствие перекрестных реакций у разработанных тест-систем для детекции и идентификации D. destructor и D. dipsaci. Подготовлен материал (образцы нематод) для разработки тест-системы для детекции северной галловой нематоды Meloidogyne hapla и достигнута договоренность с North West University (ЮАР) о предоставлении в 2018 г. ДНК двух карантинных видов нематод, паразитирующих на картофеле, но не представленных в России - M. enterolobii и M. chitwoodi. Начата разработка методических указаний по выявлению различных болезней картофеля с использованием предлагаемых диагностических ПЦР-матриц. Подготовлен раздел по вирусным и вироидным болезням картофеля. По результатам работы в 2017 г. подготовлены 5 публикаций, из них 3 – в журналах, индексируемых в Web of Science/Scopus (1 опубликована, две – на рецензии) и 2 – в журналах, индексируемых в РИНЦ/Google Scholar (обе приняты к публикации). Результаты выполнения работ по проекту были представлены в форме устных докладов на двух международных конференциях. Начата работа по организации и проведению в 2018 г. конференции по тематике выполняемого проекта (достигнута договоренность с ООО «Сингента» о совместном проведении конференции, информация о конференции размещена на сайте ВНИИ фитопатологии - http://www.vniif.ru/activities/2018/page/1468, создан организационный комитет, принимаются заявки на участие). В рамках проведения конференции будет проведена демонстрационная презентация возможностей разрабатываемых тест-систем и ПЦР-матриц, а также представлены два устных доклада по тематике конференции.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В 2018 г. была успешно завершена разработка тест-систем для выявления и идентификации экономически важных патогенов картофеля грибного происхождения: Alternaria alternata, A. solani, Rhizoctonia solani (разработка этих трех тест-систем начата в 2017 г.), Fusarium sp., Synchytrium endobioticum и Spongospora subterranea (тест-система разработана в 2017 г.). В 2018 г. к ним по рекомендации Отдела болезней картофеля и овощных культур ВНИИФ была дополнительно добавлена тест-система для возбудителя антракноза картофеля и других культур Colletotricum coccodes. Был отобран и проанализирован набор наиболее известных и исследованных генов и нуклеотидных последовательностей целевых микроорганизмов, последовательности которых были представлены в NCBI GenBank: ITS (R. solani), Alt_a1 (A. solani, A. alternata), EF1 (Fusarium sp.), Tub2 (C. coccodes). Для проверки работоспособности, чувствительности и специфичности разрабатываемых тест-систем использовали чистые культуры целевых и родственных видов, полученные из Всероссийской коллекции фитопатогенных микроорганизмов (ВКФМ) ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт фитопатологии», Биобанка "Микроорганизмы и грибы" МГУ имени М.В. Ломоносова, а также образцы ДНК штаммов из рабочей коллекции лаборатории микологии ФГБУ ВНИИКР. Оценку эффективности тест-систем в реальных условиях проводили с использованием полевых образцов картофеля и томата с видимыми симптомами грибной инфекции, собранных в различных регионах России. Результаты лабораторных испытаний на чистых культурах (образцах ДНК – в случае S. endobioticum) патогенов и на полевых образцах подтвердили эффективность, специфичность и хорошую чувствительность созданных тест-систем. Следующий этап (валидация разработанных тест-систем на полевых образцах и проверка эффективности их работы в лиофилизированной форме в составе единой диагностической микроматрицы) проводили для шести тест-систем, т.к. в случае S. endobioticum необходима проверка тест-системы на живых культурах этого карантинного микроорганизма, которые, в силу особенностей регулирования работы с карантинными микроорганизмами, достаточно сложно получить. В будущем планируется решение этой проблемы. Результаты проверки эффективности работы тест-систем в свежеприготовленной и лиофилизированной форме показали несущественные различия в показателе порогового цикла и ожидаемое повышение пороговых концентраций, остающихся, однако, вполне достаточными для полевой диагностики. Разработана топология 48-луночной микроматрицы для одновременной диагностики 5 образцов на присутствие 6 грибных патогенов. Валидация микроматриц на полевых образцах с признаками поражения листьев, стеблей или клубней грибными инфекциями продемонстрировала практически полное совпадение результатов ПЦР-анализа и микроскопического и морфологического определения патогенов. Завершено создание тест-систем для выявления и идентификации трех фитопатогенных нематод – D. destructor, D. dipsaci и D. weischeri (на базе ITS последовательностей). Выполнена лабораторная оценка эффективности, чувствительности, видоспецифичности и воспроизводимости тест-систем на живых культурах целевых нематод (фиксированной культуре в случае D. weischeri), а также культурах родственных и других видов нематод. Была выполнена проверка эффективности работы всех трех тест-систем в лиофилизированной форме после нанесения на микроматрицу; полученные результаты подтвердили отсутствие кросс-реакций и достаточную для полевой диагностики чувствительность лиофилизированных тест-систем. Тест-система для D. destructor успешно прошла валидацию на полевых образцах (для валидации остальных двух тест-систем необходимо получение полевых образцов растений, зараженных нематодами этих видов, что будет выполнено в следующий полевой сезон). Начата работа по созданию тест-систем для выявления и идентификации нескольких видов галловых нематод рода Meloidogyne, а также четырех видов фитоплазм, поражающих картофель. В последней группе патогенов тест-система на фитоплазму 16SrXII успешно прошла первый этап проверок (чувствительность и видоспецифичность), остальные тест-системы требуют доработки. В сотрудничестве с «Россельхозцентром» успешно завершен второй сезон широкомасштабных полевых испытаний ранее разработанных микроматриц для диагностики 8 вирусных/вироидных и 7 бактериальных/оомицетных болезней картофеля. Испытания проводили на базе региональных отделений Россельхозцентра в 11 регионах России. Было проанализировано 275 образцов клубней и 436 образцов листьев. Общее количество проанализированных образцов по результатам двух лет испытаний достигло 725 (клубни) и 1025 (листья). Обработка полученных данных позволила получить информацию об общем уровне присутствия целевых инфекций в регионах и выявить наиболее неблагополучные в этом отношении регионы, а также получить информацию о патогенах, доминирующих в исследованных регионах. Были получены данные о наиболее распространенности и частоте встречаемости всех целевых патогенов. Были получены уникальные данные о присутствии и составе смешанных бактериальных или вирусных инфекций на территории исследованных регионов, наиболее распространенных комбинациях, а также патогенах, чаще всего встречающихся в смешанных инфекциях. По объему и степени детализации полученная информация о смешанных вирусных инфекциях не имеет аналогов в мире. Результаты двух лет испытаний разработанных микроматриц с использованием стандартизированной методики анализа, доступной для персонала с невысоким уровнем квалификации, продемонстрировали возможности и преимущества разработанных ПЦР-матриц для широкомасштабного скрининга, а в дальнейшем и мониторинга вирусных и бактериальных заболеваний картофеля В рамках обязательств по гранту была проведена очная научно-практическая конференция «Современные проблемы и достижения в защите картофеля от болезней, вредителей и сорняков» (12-14 марта 2018 г., Большие Вяземы, Московская область). Число зарегистрировавшихся докладчиков и слушателей достигло 135, включая представителей 32 компаний производственного сектора (семеноводство, производство картофеля, производство удобрений и средств защиты картофеля). Количество докладов: 20 устных и 26 стендовых. По итогам конференции опубликовано 27 статей в журналах «Достижения науки и техники АПК» (№ 3, 2018) и «Защита картофеля» (№ 1, 2018). Результаты конференции доступны на странице http://www.vniif.ru/news/item/1493. В 2018 г. результаты работы по проекту были представлены на четырех конференциях: 1) Научно-практическая конференция с международным участием «Современные проблемы и достижения в защите картофеля от болезней, вредителей и сорняков», организованная в рамках гранта на базе ФГБНУ ВНИИФ (Большие Вяземы, 12-14 марта 2018 г.) – три устных доклада: .2) ХVth European Society for Agronomy Congress (27-30 августа 2018 г., Женева, Швейцария) – один устный доклад 3) 33rd Symposium of the European Society of Nematologists (в рамках 70th International Symposium on Crop Protection, 9-13 сентября 2018 г., Гент, Бельгия) – один устный доклад 4) Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Современные подходы и методы в защите растений» (12-14 ноября 2018 г., Екатеринбург) – один устный и один постерный доклад Было подготовлено 6 статей по результатам проведенных исследований (без учета тезисов в сборниках материалов конференций). Четыре из них были опубликованы в текущем году, одна – принята в печать и одна – находится на повторном рецензировании. В сотрудничестве со специалистами «Россельхозцентра» подготовлены методические указания «Детекция и идентификация возбудителей заболеваний картофеля с использованием ПЦР (ОТ-ПЦР) в режиме реального времени в матричном формате». В настоящее время они направлены в Министерство сельского хозяйства для процедуры рассмотрения, согласования и утверждения.