Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Проведен литературный и патентный поиск в предметной области проекта с целью обновления имеющейся базы данных по тематике проекта. Тема патентных исследований: ”Способы конъюгирования магнитных наночастиц, капсулированных углеродом с биологическими объектами в жидкой среде с последующим использованием методов ядерной магнитной релаксометрии ЯМР”. Наличие патентов в каждой из стран (Россия, США, Китай, Австралия, Великобритания, Япония, Корея, Гонконг, Израиль, Новая Зеландия) поиска на глубину 5 лет свидетельствует о том, что в настоящее время отечественные и зарубежные фирмы проявляют активность в защите своих разработок, касающихся исследуемой темы. При подготовке данной заявки также был проведен анализ литературных источников- публикаций по заявленной теме в период со средины 2016 года до конца 2017 года. Весь патентный материал по ведущим странам по теме поиска содержится в виде отчета в твердых копиях, оформленные в соответствии с требованиями ГОСТ, а статьи и публикации за последний год, включая 2016 год, содержатся на электронном носителе. Для реализации экспериментальных задач проекта были использованы оригинальные композитные наночастицы со структурой металлическое (магнитное) ядро-углеродная оболочка. Строение частиц со структурой “ядро-углеродная оболочка” позволяет решить сразу несколько задач – обеспечить биосовместимость, устойчивость структуры и свойств в биологических средах, возможность функционализации оболочки различными группами и высокую намагниченность. Синтез наночастиц осуществлялся газофазным методом. В этом методе металл испаряется из непрерывно подпитываемой перегретой капли, и его пары уносятся буферным газом (аргон), содержащим определенное количество углеводорода (бутана). Каталитический пиролиз бутана на частицах металла приводит к образованию на поверхности этих частиц углеродной оболочки, которая останавливает рост частиц. Наиболее высокой химической стабильностью (травление в кислоте) характеризуются композиты Co@C и Ni@C, которая составляет 98-99% (количество магнитной фазы после травления), стабильность композитов Fe@C после подбора режимов синтеза составляет порядка 90 %. Таким образом, из трех исследованных металл-углеродных композитов наиболее перспективными с точки зрения использования в качестве магнитных меток являются композиты Co@C и Ni@C. С другой стороны, композит Co@C обладает такими преимуществами как высокая намагниченность и высокая химическая стабильность. Несколько уступающий по этим параметрам композит Fe@C обладает таким преимуществом как низкая коэрцитивная сила. Эти различия могут отразиться на стабильности суспензий на основе исследуемых порошков в жидких средах. В ходе выполнения проекта были разработаны методы модификации поверхности наночастиц амфифильным полимером DSPE-PEG-2000 при помощи метода гидратации пленки. Такие наночастиц могут быть использованы для калибровочных измерений. Кроме того, были разработаны методы модификации поверхности наночастиц методами арил-диазониевой химии, благодаря которым становится возможным разместить на поверхности частиц амино- и карбоксильные группами, с которыми можно коньюгировать различные биологические молекулы. Предложен оригинальный метод модификации магнитных металл-углеродных наночастиц углеродными квантовыми точками (CQD). Исследования показали, что суспензии металл-углеродных наночастиц с железным и никелевым ядром относительно стабильны, тогда как наночастицы с кобальтовым ядром склонны к агломерации, возможно из-за их более высокой коэрцитивной силы. Карбоксилированные и аминированные металл-углеродные наночастицы устойчивы в относительно узком диапазоне pH, от 5 до 8 и при низкой ионной силе среды. Добавление белка (BSA) позволяет стабилизировать наночастицы в том числе и в среде с высокой ионной силой. Биологическая модель тест-системы, представляет собой количественную оценку прямого взаимодействия биотинилированного белка, бычьего сывороточного альбумина, и наночастиц Fe@C, конъюгированных со стрептавидином на поверхности твердой фазы и является простым и надежным способом продемонстрировать принцип детекции, предложенный авторами проекта: формирование скопления магнитных наночастиц на малом участке поверхности твердой фазы в зоне сорбции биотинилированного БСА, что приведет к изменению времени релаксации. При этом изменение времени релаксации пропорционально количеству связанных с твердой фазой наночастиц, а, значит, и концентрации сорбированного биотинилированного БСА. Такая модель позволяет подтвердить зависимость интенсивности сигнала (времени релаксации) от концентрации вещества-мишени (биотинилированного БСА). Удобство выбранной модели определяется рядом факторов. Во-первых, это высокая скорость реакции формирования комплекса стрептавидин-биотин, которая достигает равновесия за несколько минут при комнатной температуре. Во-вторых, это высокая избирательность реакции биотин-стрептавидин. В-третьих, существенным преимуществом является то, что процесс биотинилирования БСА представляет собой надежную и отработанную методику. Полученные результаты позволили синтезировать конъюгаты железо-углеродных наночастиц со стрептавидином (Fe@C-Str), общее количество синтезов – 5. Принцип конъюгирования заключается в ковалентной пришивке стрептавидина к молекулам БСА, нековалентно сорбированным на поверхности наночастиц. Анализ данных обратного динамического светорассеяния говорит о том, что большая часть частиц имела размеры порядка 100 нм на всех стадиях синтеза. Выход синтеза составлял в среднем 93-98%. Визуально конъюгат Fe@C-Str представлял собой оптически плотную, однородную суспензию наночастиц, спустя сутки хранения в при +4°С на дне флакона образовался осадок агрегировавших наночастиц, однако даже спустя неделю хранения количество осадка существенно не менялось, о чем свидетельствует не только визуальное наблюдение, но и отсутствие значимого изменения оптической плотности надосадочной жидкости в сравнении с исходной суспензией. Разработанный метод позволяет функционализировать магнитные наночастицы, покрытые углеродом, белками, а также другими соединениями, содержащими химические группы, способные формировать стабильные ковалентные связи с альдегидными группами глутаральдегида. Важно отметить, что данный метод может быть модифицирован путем применения других бифункциональных сшивающих агентов, что позволит расширить спектр молекул, доступных для конъюгирования. Предлагаемая методика функционализации магнитных наночастиц достаточно оперативна, не требует жестких физико-химических условий и сложного, дорогостоящего оборудования, все реакции проводятся в водной среде при мягких условиях. В ходе экспериментов было показано, что максимальная релаксивность достигается в суспензиях, содержащих наночастицы Fe@C на частоте 4 МГц. Продемонстрирована возможность построения калибровочной зависимости с использованием мембраны 8 мкм и наночастиц Fe@C-St. При капельном способе нанесения наблюдается неоднородность распределения по временам релаксации, что затрудняет анализ результатов и ухудшает аналитические характеристики методики. Достигнутый предел обнаружения при сорбционном способе нанесения порядка 1 нг/мл. Была рзработана принципиальная схема и уникальный лабораторный прибор, работа которого основана на явлении ядерного магнитного резонанса (ЯМР-релаксометр) для детекции биообъектов на твердой фазе. Изготовлен лабораторный макет прибора. Это устройство для импульсного возбуждения Ларморовской прецессии ядер водорода и приема затухающих сигналов ЯМР имеет полностью цифровой приемный тракт, обеспечивающий качественную цифровую фильтрацию сигналов, что позволяет получить более высокое отношение сигнал/шум. Тем самым становится возможным определение времени релаксации T2 в образцах объемом в единицы микролитров на частоте 4 МГц с высокой точностью. Важно также то, что при разработке устройства со столь высокими параметрами широко использовались компоненты отечественного производства.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Целью работы в отчетном году была разработка технологии синтеза стабильных биоконъюгатов магнитных железоуглеродных наночастиц (Fe@C), которые могут быть использованы для создания систем диагностики на основе ЯМР-релаксометрии. Мы использовали комплексный подход к функционализации наночастиц. В первую очередь осуществили аминирование углеродной оболочки магнитных наночастиц, на которую затем нековалентно сорбировали молекулы бычьего сывороточного альбумина (БСА). Частицы обрабатывали глутаральдегидом, что обеспечивало кросс-сшивку молекул БСА и предоставляло возможность для ковалетнтного присоединения биомолекул, в данном случае моноклональных антител, специфичных к простатспецифическому антигену человека (ПСА). Предлагаемый метод анализа ПСА основан на количественной оценке концентрации магнитных наночастиц, находящихся на поверхности твердой фазы, при помощи ЯМР-релаксометрии. По своему формату метод напоминает традиционный твердофазный иммуноферментный анализ с тем исключением, что вместо ферментной метки используются магнитные железоуглеродные наночастицы. В качестве твердой фазы использовали нитроцеллюлозную мембрану, концентрацию наночастиц определяли при помощи портативного релаксометра. Преимуществом железоуглеродных наночастиц является их высокая намагниченность насыщения и химическая стабильность, которую обеспечивает углеродная оболочка, защищающая ядро. Была разработана методика синтеза металл-углеродных наночастиц с ядром, состоящим из сплава двух 3d металлов. Были синтезированы наночастицы сплавов CoFe@C и NiFe@C с разным соотношением металлических компонентов. Были изучены различные составы в ряду Fe-Co и Fe-Ni, было показано, что у наночастиц с биметаллическим ядром коррозионная устойчивость в целом выше (98-99% в концентрированной HCl), чем у наночастиц с ядром из чистого железа (80-90 в концентрированной HCl). При этом намагниченность насыщения наночастиц NiFe@C ниже, чем у наночастиц с ядром из чистого железа (около 60 emu/g), а у CoFe@C превосходит их (порядка 130 emu/g). При этом у наночастиц CoFe@C наблюдается коэрцитивная сила в 60 Oe. Релаксивность наночастиц в водных суспензиях CoFe@C сравнима с релаксивностью для Fe@C, однако в больших полях наблюдается агрегативная неустойчивость, снижающая релаксивность, что обусловлено наличием коэрцитивной силы. Эта проблема будет устранена при подборе соответствующей методики стабилизации суспензии. Были исследованы зависимости релаксивности от свойств поверхностной модификации наночастиц. Исследовали влияние аминогрупп (-NH2) и карбоксигрупп (-COOH), было показано, что релаксивность отличается незначительно для разных модификаций, составляя 430 1/с*мМ для карбоксилированных наночастиц и 520 1/с*мМ для аминированных. Кроме этого была изучена зависимость релаксивности от размера агломерата, модифицированного белком BSA. При этом было показано, что релаксивность изменяется практически линейно в диапазоне размеров агломератов от 80 до 220 нм и составляет, соответственно, 520 1/с*мМ и 350 1/с*мМ. Был сконструирован портативный ЯМР релаксометр, способный работать на частоте 8 МГц. Разработана магнитная система и измерительная ячейка для образцов малого объема. Было показано, что соотношение сигнал/шум существенно для этой частоты увеличилось по сравнению с системой, работающей на частоте 4 МГц. Для релаксометра, работающего на частоте 2 МГц эта величина составляла 5.5 и 170, а для прибора с рабочей частотой 8 МГц 18 и 380, для объема образца 5 и 100 мкл соответственно. По итогам работы была оптимизирована технология конъюгирования железоуглеродных наночастиц с моноклональными антителами. Мы подтвердили, что процедура синтеза хорошо воспроизводится и позволяет получать стабильные конъюгаты. Размер наночастиц, конъюгированных с моноклональными антителами, составляет порядка 140-150 нм и может быть изменен в большую или меньшую сторону при помощи варьирования условиями конъюгирования. Предлагаемый метод не требует использования сложного оборудования и дорогостоящих реактивов. Для приготовления одной партии конъюгированных наночастиц требуется не более 24 часов. Высокая стабильность функционализированных антителами наночастиц и относительно высокая релаксивность (в сравнении с современными аналогами) делают их перспективными кандидатами для применения в ЯМР-анализах и даже магнитно-резонансной томографии. Синтезированные конъюгаты были использованы для детекции ПСА методом ЯМР релаксометрии в формате дот-иммуноанализа. Чувствительность детекции ПСА составила 0,31 нг/мл. Для оценки воспроизводимости тест-системы были в 8 повторностях протестированы образцы, содержащие ПСА в концентрациях 0,5, 1 и 5 нг/мл. Коэффициент вариации во всех случаях составил менее 15%. Специфичность анализа оценивали, используя образцы, содержащие вместо ПСА человеческий сывороточный альбумин (в концентрациях от 20 до 1 мг/мл) и калликреин-2 в концентрациях от 10 до 0,1 нг/мл. Неспецифического сигнала в обоих случаях не было обнаружено.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
H1 ЯМР релаксометрия - это метод, который чрезвычайно чувствителен к присутствию магнитных наночастиц, которые значительно влияют на поперечное время релаксации протона воды. Использование магнитных наночастиц в качестве меток позволяет обнаруживать даже очень небольшие количества исследуемого вещества. Для повышения чувствительности метода были синтезированы новые стабильные нанокомпозиты с высокой величиной намагниченности. Разработан новый ЯМР-релаксометр до 20 МГц с существенно улучшенными характеристиками по сравнению с 8 МГц, как по соотношению сигнал/шум (в пять раз лучше на одиночном образце). Кроме того, ЯМР-релаксометр обеспечен “stripe” системой, позволяющей с высокой чувствительностью измерять параметры времени спин-спиновой релаксации Т2 нескольких образцов микролитрового объема в режиме последовательного сканирования. В ходе реализации проекта разработана технология синтеза диагностических реагентов на основе наночастиц, позволяющих осуществлять высокочувствительную детекцию онкомаркеров (в частности простатспецифического антигена), а также других клинически значимых молекул в сыворотке крови человека. Диагностические реагенты представляют собой наночастицы, стабилизированные слоем белка, к которому ковалентно «пришиты» распознающие молекулы. Белками-стабилизаторами могут служить альбумин, казеин или желатин. Варьируя условия синтеза конъюгатов, можно получать наночастицы различных размеров. Преимуществами синтезированных наночастиц являются их высокая стабильность при хранении, стабильность в широком диапазоне рН и концентрации солей, термостабильность, позволяющая использовать их в областях, где требуется воздействие повышенных температур, в частности анализах, основанных на амплификации нуклеиновых кислот. Разработанные диагностические реагенты были использованы для создания тест-систем, предназначенных для обнаружения простатспецифичнеского антигена. Были сконструированы различные варианты тест-систем, из которых наибольшую эффективность показали дот-иммуноанализ и объемный анализ с элюцией наночастиц. Второй из них является уникальным методом, поскольку в нем сочетаются преимущества твердофазного анализа (высокая специфичность) и анализа в объеме жидкости, что обеспечивает высокую чувствительность детекции.