Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Разработаны протоколы получения гибридных покрытий с участием ДНК и электрополимеризованных материалов (анилин, тионин, толуидин, нейтральный красный), обеспечивающие высокую чувствительность определения антрациклиновых препаратов, а также задачи распознавания нативной, окисленной и денатурированной ДНК. С этой целью установлены рабочие условия полимеризации указанных соединений и проведено сравнение различных способов включения в них ДНК (внесение в реакционную смесь, электростатическое осаждение на поверхности слоя, включение в полиэлектролитные комплексы с помощью самосборки). В случае полианилина выявлен темплатный эффект ДНК, состоящий в стабилизации окисленных форм полимера и расширении области допирования и электрохимической активности гибридного материала. Рассмотрено влияние концентрации ДНК и ее предварительной термической обработки и окисления на внутреннюю электрохимическую активность полианилина. С привлечением данных атомно-силовой микроскопии и спектроскопии электрохимического импеданса показано изменение морфологии поверхности получаемых покрытий в результате гранулирования полимера и связь этих процессов с электропроводностью покрытия. Полученные покрытия полианилина с нативной ДНК реагировали на антрациклиновые препараты путем снижения пиков окисления-восстановления полианилина и увеличения сопротивления переноса заряда за счет экранирования фосфатных групп ДНК протонированными молекулами антрациклинов. Впервые предложено для повышения чувствительности определения антрациклинов дополнительно насыщать слой ДНК метиленовым синим. Конкуренция с молекулами антрациклинов приводит к вытеснению молекул красителя и снижению его участия в электронном обмене в слое. В результате удалось достичь предела обнаружения доксорубицина до 0.01 нМ. Не выявлено селективности сигнала в отношении других антрациклиновых препаратов, но их разделение возможно за счет различной скорости переноса в полимерную пленку. Впервые предложено замещение ДНК в составе гибридных материалов с полианилином после измерения антрациклиновых препаратов путем гидролитического разрушения и удаления ДНК из слоя действием соляной кислоты с последующим сорбционным замещением ДНК, не контактировавшей с аналитами. Удаление ДНК и регенерация покрытия были подтверждены с помощью спектроскопии электрохимического импеданса. Относительный вклад электростатических взаимодействий исследован с использованием полиэлектролитных комплексов с участием ДНК и синтетических полиэлектролитов (полиаллиламин, полидиметилдиаллиламмоний хлорид, полистиролсульфонат), сформированных на золоте, путем анализа поверхностного плазмонного резонанса. Установлено, что эффективность сборки полиэлектролитов зависит от гидрофильности и конформационной гибкости молекул поликатионов. Выявлены критерии разделения вклада нативной, денатурированной и окисленной ДНК по их влиянию на сигнал сенсора (сдвиг угла поверхностного плазмонного резонанса). Определено, что включение молекул доксорубицина в состав нативной ДНК снижает эффективность сборки полиэлектролитных комплексов за счет изменения жесткости и внутреннего объема молекул биополимера. Определена возможность разделения эффектов, связанных с интеркалированием и окислительным повреждением структуры ДНК, показана возможность регистрации защитного эффекта антиоксидантов, снижающих действие активных форм кислорода на ДНК. Проведено сравнение аналитических и операционных характеристик ДНК-сенсоров на основе полианилина и полимерной формы нейтрального красного с послойной иммобилизацией ДНК, полиаминированного производного тиакаликс[4]арена и полистиролсульфоната. Сигналом сенсора служило изменение сопротивления переноса заряда, устанавливаемое по данным спектроскопии электрохимического импеданса в присутствии феррицианид-ионов. Показано, что наибольшей чувствительностью определения антрациклиновых препаратов обладает сенсор на основе поли(нейтрального красного), предел обнаружения составил до 0.1 нМ препарата, селективности отклика в отношении структурно родственных антрациклинов не выявлено. Вклад полиаминированного тиакаликс[4]арена связан с экранированием молекул ДНК и обеспечением электростатической сборки противоположно заряженных компонентов комплекса. Сборка полиэлектролитов на слое поли(нейтрального красного) подтверждена с помощью сканирующей электронной микроскопии. Тионин и толуидин при электрополимеризации показали меньшую эффективность, чем нейтральный красный и анилин. Внесение ДНК в реакционную смесь незначительно влияло на вольтамперные характеристики покрытий. Нанесение ДНК поверх слоя полимера позволяет разделить нативную, денатурированную и окисленную формы биополимера по изменениям формы, положения и высоты пиков на вольтамперограммах. Показано снижение сопротивления переноса заряда политионина в присутствии ДНК и возможность разделения влияния интеркалирования и электростатических взаимодействий с ДНК по направлению изменения параметров импеданса и синхронности изменения сопротивления и емкости поверхностного слоя. Все разработанные ДНК сенсоры были протестированы на искусственных образцах, имитирующих биологические жидкости. Установлено, что мешающее влияние матрицы связано с высокой концентрацией низкомолекулярных электролитов, присутствием белков и неоптимальным рН. Предложены способы пробоподготовки, нивелирующие указанные факторы. Высокая чувствительность определения антрациклинов позволяет также разбавлять образцы с возможностью надежной регистрации диагностически значимых концентраций лекарственных препаратов. Степень открытия антрациклинов (на примере доксорубицина) составляет не менее 85%.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Рассмотрены особенности электрохимической полимеризации метиленового синего, Азура Б и тионина. Во всех случаях введение в раствор ДНК снижает эффективность полимеризации и количество полимера, накапливаемого на электроде. В случае поли(метиленового синего) ДНК меняет соотношение пиков окисления-восстановления полимерной и мономерной формы красителя в пользу первой. В случае тионина введение 0.05-0.5 мг/мл ДНК в раствор для полимеризации снижает токи пиков в 4-5 раз, а их ширина по шкале потенциалов удваивалась. Присутствие доксорубицина в концентрации до 100 нМ не влияло на процесс полимеризации и электрохимические характеристики политионина. Полимеризация метиленового синего и тионина оказалась нечувствительна к источнику ДНК. Предложены методики проведения полимеризации, позволяющие качественно разделять влияние образцов ДНК, повергнутых окислительной и температурной деградации. При полимеризации Азура Б на циклических вольтамперограммах присутствуют пики мономерной и полимерной форм. Токи закономерно увеличиваются с числом циклов сканирования потенциала. Установлены стехиометрия переноса электрона и ионов водорода в лимитирующей стадии процесса (2:1). Исследованы возможности постадийного получения гибридных покрытий с нанесением ДНК после электрополимеризации красителя. В случае политионина и поли(метиленового синего) сорбционное накопление ДНК не привело к существенному улучшению функций распознавания биоспецифических взаимодействий ДНК. Полимерное покрытие Азура Б оказалось более чувствительным к введению ДНК. Присутствие ДНК подавляло сигнал поли(Азура Б) на 50% в случае инкубирования и 70% - при протоколе высушивания - отмывания. Относительное изменение катодного тока пика поли(Азура Б) линейно зависело от логарифма концентрации ДНК с пределом обнаружения, отвечающим присутствию на электроде 0.43 фемтомоль ДНК. Последующее инкубирование биосенсора в растворе доксорубицина приводит к частичному восстановлению электрохимической активности полимера (предел обнаружения 0.07 нМ, 50% изменение при 3.7 нМ). Указанные значения соответствуют или превосходят аналитические характеристики аналогичных ДНК-сенсоров, полученных с использованием биохимических принципов анализа (аптамеры на доксорубицин, специфические антитела, прямое окисление доксорубицина на электроде с адсорбированной ДНК). Получены смешанные покрытия с включением ДНК между электрополимеризованным анилином и тиазиновыми красителями. Электрополимеризация анилина улучшает последующие условия регистрации электрохимических характеристик полимерных форм метиленового синего, метиленового зеленого и нейтрального красного за счет более высокой скорости переноса электрона и электростатических взаимодействий между отдельными компонентами слоя. Сорбционное накопление ДНК стабилизирует полуокисленную форму эмералдина, которая сохраняет электрохимическую активность в нейтральной среде. После этого ДНК закрывали слоем политиазинового красителя, который получали также в течение четырех циклов сканирования потенциала. Проведена оптимизация основных параметров получения слоя. Сканирующая электронная и атомно-силовая микроскопия подтвердили включение физически адсорбированной ДНК в состав слоя полианилина и последующее покрытие биополимера слоем политиазиновых красителей. Электрохимические свойства полученных гибридных покрытий были охарактеризованы, используя стандартные растворы антиоксидантов в интервале их концентраций от 1 мкМ до 1 мМ. Сигналы аскорбиновой кислоты, гидрохинона, и кверцетина сложным образом зависели от состава модифицирующего покрытия, рН и концентрации. Абсолютная высота пиков красителей закономерно уменьшалась с увеличением рН раствора вследствие изменения электропроводности подстилающей пленки полианилина. В кислой области увеличение концентрации аскорбиновой кислоты увеличивало ток окисления политиазина за счет химической регенерации восстановленной формы красителя. Катодный пик менялся в противоположном направлении. Абсолютное значение пиков уменьшалось в ряду поли(Нейтральный красный) > поли(Метиленовый синий) > поли(метиленовый зеленый), что отвечает изменению стандартного потенциала указанных соединений Расширен круг лекарственных препаратов противоракового действия, способных взаимодействовать с ДНК и регистрируемых электрохимически. Были выбраны акридиновые препараты – профлавин и акридиновый желтый. Сложность их изучения связана с тем, что они весьма слабо растворимы в воде, что исключает получение достоверных концентрационных зависимостей сигналов. Нами были исследованы условия их осаждения на электроде с последующей адсорбцией ДНК и регистрацией электрохимических характеристик, чувствительных к указанным биохимическим взаимодействиям. Образование полимерной пленки профлавина в многократном сканировании потенциала нашло подтверждение с помощью электрохимического варианта пьезокварцевого микровзвешивания. На золотом пленочном электроде регистрировали те же пики, что и на стеклоуглеродном электроде, однако на обратной ветви вольтампрограммы дополнительно был виде необратимый катодный пик восстановления оксидов золота, пропадающей с увеличением числа циклов сканирования потенциала. Было предложено проводить послойную иммобилизацию профлавина и ДНК в раздельных стадиях, меняя природу электролита. В указанных экспериментах сначала получали устойчивую пленку полипрофлавина, после чего электрод промывали и на его поверхность наносили раствор ДНК, Последующее измерение токов пика показало положительное влияние ДНК на анодные токи пика, увеличивающиеся на 15-20%. Катодные токи пика полипрофлавина в присутствии ДНК своей значения не меняли. Включение ДНК в пленку поверх слоя полипрофлавина нашло подтверждение в методе электрохимической спектроскопии импеданса. Сходные эксперименты были проведены на стеклоуглеродном электроде, покрытом углеродной чернью, для него исследование осаждения ДНК проводили с помощью дифференциально-импульсной вольтамперометрии. По сравнению с чистым стеклоуглеродом ток окисления увеличивался в 6 раз, так восстановления – в 3 раза. По результатам скрининга электрохимической активности аналогичные измерения были проведены с помощью акридинового желтого. Установлено влияние фонового электролита на эффективность полимеризации акридинового желтого и выявлен факт ускорения процесса в присутствии нитрат-ионов, проявляющийся для всех исследованных буферных систем и концентраций фонового электролита. Количество ДНК по данным пьезокварцевого микровзвешивания не зависит от концентрации в растворе, а определяется рН и количеством циклов сканирования потенциала на стадии полимеризации препарата. Присутствие ДНК снижало сопротивление переноса заряда на границе электрод – раствор и нивелировало значение токов окисления-восстановления поли(акридинового желтого). Также наблюдалось уменьшение разброса значений токов пика, максимальное для продукта полимеризации из фосфатного буферного раствора и минимальное – из трифторуксусной кислоты. Найденные закономерности в дальнейшем найдут применение при конструировании ДНК-сенсоров для определения препаратов противоракового действия и регистрации повреждения ДНК активными формами кислорода. Проведено сравнительное исследование электрохимических характеристик полианилина, полученного в присутствии поликатионных полиэлектролитов и ДНК. Влияние полиэлектролитов определяется их способностью к электростатическим взаимодействиям с ДНК. Если совокупный заряд молекулы ДНК превышает заряд полиэлектролита, молекулярные комплексы заряжены отрицательно, их влияние на электрополимеризацию анилина незначительно отличается от влияния ДНК меньшей концентрации. Увеличение абсолютной концентрации ДНК в реакционной смеси независимо от концентрации полиэлектролита при сохранении общего отрицательного заряда увеличивает разброс токов пика и снижает стабильность электрохимических сигналов на вольтамперограммах. Спектроскопия электрохимического импеданса установила снижение сопротивления переноса заряда в области низких концентраций ДНК и увеличение – при брутто-концентрации полимера, превышающей 0.1 мг/мл. Соотношение концентраций ДНК и полиэлектролита в наибольшей степени влияет на емкость, которая следует изменению формального заряда комплекса ДНК – полиэлектролит. В том случае, когда полиэлектролиты брали в большом избытке относительно ДНК, при их взаимодействии следовало ожидать образования катионных комплексов, влияние которых на полимеризацию будет во всех случаях отрицательным. Разработанные ДНК-сенсоры были протестированы на образцах искусственной плазмы крови, сыворотки крови и урины здоровых доноров. При определении доксорубицина не было установлено значимого различия в поведении чистого вещества и препаратов, производимых фармацевтическими кампаниями TEBA и LANS, содержащими дополнительно стабилизаторы (лактозу и маннол). Предложена простая пробоподготовка для снижения влияния компонентов биологической матрицы, включая смешение пробы с метанолом, отделение выпадающих белков с помощью ультрацентрифугирования и последующее разбавление образца рабочим буферным раствором до соотношения 1:10 для элиминирования влияния органического растворителя. Сенсоры на основе полианилина, ДНК и полимерных форм фенотиазиновых красителей, полученных путем электрополимеризации и сорбционного накопления ДНК, испытывали в классификации образцов чая по уровню их антиоксидантной емкости с помощью метода главных компонент (доля объясненной дисперсии 91.1%) и линейного дискриминантного анализа (100% успешность прогноза марки чая для пяти образцов, купленных в местной торговой сети). Выявлена корреляция между антиоксидантной емкостью чая по результатам кулонометрического титрования и результатами измерения нормализованных токов пика красителей.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Проведено сравнительное исследование условий формирования поверхностных слоев ДНК-сенсоров на основе углеродных наноматериалов (углеродная чернь, восстановленный оксид графена), медиаторов электронного переноса (серебро, фталоцианин кобальта, супрамолекуряные производные пирокатехина) с целью выявления оптимальных условий иммобилизации ДНК и измерения сигнала ДНК- сенсора в отношении повреждающих факторов и интеркаляторов. Определены условия нанесения медиаторов и их вклад в сигналы на вольтамперограммах до и после электрополимеризации фенотиазиновых красителей. Установлено влияние собственных редокс-пиков медиаторов на сигналы полимерных форм метиленового синего и тионина. Определены сочетания модифицирующих компонентов, обеспечивающие максимальный и наиболее устойчивый сигнал при иммобилизации ДНК. Выявлен вклад полиэлектролитов (хитозан и полиэтиленимин), стабилизирующих слои противоположно заряженных компонентов (ДНК и углеродные наноматериалы), но сохраняющих способность ДНК участвовать в биохимических взаимодействиях с низкомолекулярными агентами. Установлена возможность установления термического повреждения ДНК по ее влиянию на токи пика полимерных форм фенотиазинов на электроде. Показано, что в тех же условиях интеркалирование ДНК большого влияния на сигнал не оказывает. Это открывает путь к повышению селективности ДНК-сенсора при разделении вклада повреждения и интеркалирования ДНК в сложных матрицах. Исследовано поведение акридинового желтого G на электродах, модифицированных углеродной чернью, и выявлено влияние адсорбции на проявление его электрохимической активности. Установлено разнонаправленное влияние рН на пики окисления и восстановления акридинового желтого G в присутствии ДНК. Проведено сравнение сигнала акридинового желтого G при его нахождении в растворе и в адсорбированном состоянии на электроде. Определено участие хитозана в стабилизации слоя углеродная чернь (акридиновый желтый G) – ДНК. Показана возможность регистрации сигнала о присутствии ДНК в анализируемом растворе и определении интеркаляторов ДНК по вольтамперометрическому сигналу акридинового желтого G. Впервые предложен ДНК-сенсор на основе смешанного покрытия, полученного при сополимеризации Азура Б и профлавина на стеклоуглеродном электроде. Установлено участие обоих красителей в реакции сополимеризации путем отнесения пиков и сравнительного анализа электрохимических показателей переноса электрона и положения пиков индивидуальных красителей и их смеси. С помощью интегрирования циклических вольтамперограмм установлено изменение доминирующей формы полимера и лимитирующей стадии его образования при увеличении числа циклов сканирования потенциала. Образование полимера и его последующее взаимодействие с ДНК с образованием наноразмерных агрегатов было подтверждено с помощью сканирующей электронной микроскопии. Установлена устойчивость сигнала полученного биосенсора к антиоксидантам, включая те, которые применяются при стабилизации лекарственных форм (маннит, гидрохинон, лактоза). Это дает преимущество ДНК-сенсору при контроле качества лекарственных препаратов, а также при анализе биологических жидкостей, содержащих остаточные количества лекарств. Вместе с тем, разработанный биосенсор реагировал увеличением сопротивления переноса заряда в спектроскопии электрохимического импеданса на контакт ДНК с доксорубицином. Предел обнаружения препарата составил 0.01 нМ (интервал определяемых концентраций от 0.03 до 10 нМ). Показано, что влияние доксорубицина на параметры импеданса обусловлено увеличением сопротивления слоя диффузионному переносу лекарства, а не варьированию электростатических взаимодействий, как обычно в аналогичных ДНК-сенсорах. ДНК-сенсор был апробирован в измерении доксорубицина в искусственных образцах плазмы крови, растворе сывороточного альбумина. Определено минимальное разведение образца, достаточное для снятия влияния мешающих компонентов. Биосенсор отличается от аналогов более широкой рН-устойчивостью сигнала, независимостью отклика от присутствующих в образце электрохимически активных примесей, работой в нейтральной среде. Разработан ДНК-сенсор на основе электрополимеризованных модифицирующих покрытий и аптамера для определения микотоксинов (на примере афлатоксина М1). Выбор аналита связан с термической устойчивостью афлатоксина М1, который образуется в результате метаболического превращения афлатоксина В1 и выводится из организма коровы с молоком. Это приводит к опасности загрязнения указанным потенциально канцерогенным соединением молока и продуктов его переработки (кисломолочные изделия, сыры). Аптасенсор получали путем последовательного осаждения полианилина из раствора мономера в щавелевой кислоте и электростатической адсорбции специфического аптамера 5’- NH2-ACT GCT AGA GAT TTT CCA CAТ. Оптимизированы условия осаждения полианилина, количество аптамера и способ его иммобилизации. В частности, впервые предложено дополнительно покрывать аптамер сверхтонкой пленкой полианилина для его стабилизации и исключения мешающего влияния высокомолекулярных примесей. Инкубирование биосенсора в растворе аналита приводило к закономерному снижению сигналов окисления-восстановления полианилина. Изменение анодного тока пика линейно зависело от концентрации афлатоксина М1 в интервале 5 - 120 нг/л при инкубировании 60 мин. и 5-90 нг/л при инкубировании 20 мин. Пределы обнаружения составили 2 и 3 нг/л. В режиме измерения электрохимического импеданса увеличение концентрации афлатоксина М1 увеличивало сопротивление переноса заряда на границе биосенсор – раствор при сохранении постоянства емкости границы раздела. Изменение сопротивления внутренней границы раздела фаз линейно зависело от концентрации афлатоксина М1 в интервале 10-90 нг/мл, внешней границы раздела – 5-30 нг/л. Предел обнаружения, рассчитанный для соотношения сигнал/шум = 3, несущественно отличался от полученного ранее для вольтамперометрического определения (5 и 1нг/л, соответственно). Импедиметрический сигнал оказался более воспроизводимым, чем вольтамперометрический, и зависел от абсолютного значения концентрации аналита, а не ее логарифма. Установленные характеристики вольтамперометрического и импедиметрического определения афлатоксина М1 не уступают характеристикам аналогичных биосенсоров на основе аптамеров и специфических антител и превосходят их по простоте формирования биочувствительного слоя и продолжительности измерения. Аптасенсор показал селективность сигнала как в отношении других микотоксинов (афлатоксин В1 и охратоксин А), так и при замене аптамера на не селективный к афлатоксину М1. Все разработанные ДНК-сенсоры и аптасенсоры были опробованы на примере искусственных образцов биологических жидкостей, включая сыворотку крови и урину. Выявленная систематическая ошибка и увеличение погрешности измерения были отнесены к присутствию в пробах микронеоднородностей. Определены общие рекомендации по уменьшению влияния компонентов биологических жидкостей, включающие выбор оптимального разбавления, увеличение концентрации буферного раствора, адаптацию рН измерения. В целом вольтамперометрические измерения характеризуются меньшим значением погрешности определения, включая влияние на измерение мешающих компонентов анализируемых проб. Они же проще по исполнению и могут проводиться с использованием упрощенных анализаторов по типу оксиметров. Измерение электрохимического импеданса требует более высокой квалификации оператора и более чувствительно к биохимическим взаимодействиям ДНК. В большинстве рассмотренных вариантов конструирования биосенсоров импедиметрические системы регистрации сигнала одновременно показали и большую чувствительность к составу объекта анализа. На этом фоне выделяется сополимер Азура Б и профлавина, для которого импедиметрическая система оказалась менее чувствительной к компонентному составу пробы, чем аналоги с другими полимерными красителями.