КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 17-73-20024

НазваниеНовые полимерные гибридные материалы для определения лекарственных препаратов и биоспецифических взаимодействий с участием ДНК

РуководительПорфирьева Анна Вениаминовна, Кандидат химических наук

Организация финансирования, регионфедеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Казанский (Приволжский) федеральный университет", Республика Татарстан (Татарстан)

Срок выполнения при поддержке РНФ 07.2017 - 06.2020  , продлен на 07.2020 - 06.2022. Карточка проекта продления (ссылка)

КонкурсКонкурс 2017 года по мероприятию «Проведение исследований научными группами под руководством молодых ученых» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными

Область знания, основной код классификатора 03 - Химия и науки о материалах, 03-205 - Аналитическая химия

Ключевые словаДНК-сенсор, биосенсор, электрохимический сенсор, самосборка, полиэлектролитный комплекс, противораковые препараты, электрополимеризация, полианилин, анализ лекарственных препаратов

Код ГРНТИ31.19.29


СтатусУспешно завершен


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
Проект направлен на создание новых ДНК-сенсоров, предназначенных для регистрации биохимических взаимодействий с участием ДНК, включая определение противораковых препаратов цитостатического действия и соединений, повреждающих ДНК. Актуальность решения данной проблемы связана с растущим распространением онкологических заболеваний и недостаточностью диагностических средств контроля токсичных лекарственных препаратов в биологических жидкостях. Кроме того, предлагаемый проект может сократить расходы времени и средств на разработку новых лекарств с пониженной токсичностью и высокой эффективностью действия. Для решения поставленной проблемы предполагается создать гибридные материалы, состоящие из ДНК и поликатионных молекул, получаемых путем электрополимеризации ароматических аминов или феназинов на поверхности преобразователя сигнала. Формирование полиэлектролитного комплекса определяется электростатическими взаимодействиями, поэтому изменение распределения заряда в молекуле ДНК при ее контакте с низкомолекулярным аналитом приведет к изменению характеристик комплекса. Это можно зарегистрировать по электрохимическим характеристикам редокс-полимеров или по изменению проницаемости гибридного материала для низкомолекулярных носителей заряда с помощью постояннотоковой вольтамперометрии и спектроскопии электрохимического импеданса. Состав пленок гибридных материалов планируется контролировать также с помощью сканирующей электронной и атомно-силовой микроскопии. Для достижения селективности сигнала сенсора планируется использовать технологию молекулярных отпечатков, проводя полимеризацию в присутствии комплекса ДНК-аналит. В ходе выполнения проекта будут установлены зависимости, связывающие состав и способ получения новых гибридных материалов и чувствительность и селективность определения противораковых препаратов. Будут определены условия получения полимерных поликатионных продуктов, исключающие денатурацию ДНК. Для этого планируется проводить полимеризацию в пульсирующем режиме и в присутствии защитных агентов. В качестве полимерной матрицы для включения ДНК будут опробованы сополимеры полианилина и ряда ароматических аминов. Предполагается провести широкое сравнение аналитических характеристик определения веществ, по-разному реагирующих с ДНК (интеркалирование, взаимодействие по малым бороздкам спирали ДНК, неспецифические электростатические взаимодействия) в зависимости от способа включения ДНК в биочувствительный слой (из реакционной смеси или с предварительной адсорбцией) и режима измерения сигнала (вольтамперометрический и импедиметрический). Планируется установить возможное мешающее влияние компонентов биологических жидкостей и адаптировать протоколы измерения сигнала путем проведения измерений в искусственных биологических жидкостях. Предполагается достижение субнаномолярных пределов обнаружения цитостатиков при общем времени измерения сигнала не более 3 минут.

Ожидаемые результаты
В результате выполнения проекта будут получены новые гибридные материалы, представляющие собой полиэлектролитные комплексы ДНК и электрохимически активных полимеров, получаемых путем полимеризации. Будут установлены зависимости типа «структура-свойство», связывающие состав и способ получения комплекса, с одной стороны, и характеристики определения низкомолекулярных соединений, специфически связывающихся с ДНК, с другой. Будут разработаны протоколы измерения индивидуальных лекарств противоракового действия антрациклинового и фенотиазинового ряда с пределом обнаружения не хуже 0.1 нМ и временем измерения сигнала до 3 минут, что превосходит параметры существующих аналогичных биосенсоров, описанных в литературе. Для достижения селективности отклика будет использована технология молекулярных отпечатков, позволяющая определять индивидуальные соединения с использованием универсального протокола измерения сигнала – вольтамперометрического и импедиметрического. Будут разработаны методики определения аналитов в искусственных биологических жидкостях, учитывающие возможное влияние на сигнал сывороточных белков и электролитов крови. Внедрение полученных результатов в практику медицинской диагностики улучшит качество предоставляемых медицинских услуг за счет более своевременной и точной информации о фармакокинетике токсичных противораковых препаратов и наличии онкогенов в пищевой продукции и окружающей среде.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Разработаны протоколы получения гибридных покрытий с участием ДНК и электрополимеризованных материалов (анилин, тионин, толуидин, нейтральный красный), обеспечивающие высокую чувствительность определения антрациклиновых препаратов, а также задачи распознавания нативной, окисленной и денатурированной ДНК. С этой целью установлены рабочие условия полимеризации указанных соединений и проведено сравнение различных способов включения в них ДНК (внесение в реакционную смесь, электростатическое осаждение на поверхности слоя, включение в полиэлектролитные комплексы с помощью самосборки). В случае полианилина выявлен темплатный эффект ДНК, состоящий в стабилизации окисленных форм полимера и расширении области допирования и электрохимической активности гибридного материала. Рассмотрено влияние концентрации ДНК и ее предварительной термической обработки и окисления на внутреннюю электрохимическую активность полианилина. С привлечением данных атомно-силовой микроскопии и спектроскопии электрохимического импеданса показано изменение морфологии поверхности получаемых покрытий в результате гранулирования полимера и связь этих процессов с электропроводностью покрытия. Полученные покрытия полианилина с нативной ДНК реагировали на антрациклиновые препараты путем снижения пиков окисления-восстановления полианилина и увеличения сопротивления переноса заряда за счет экранирования фосфатных групп ДНК протонированными молекулами антрациклинов. Впервые предложено для повышения чувствительности определения антрациклинов дополнительно насыщать слой ДНК метиленовым синим. Конкуренция с молекулами антрациклинов приводит к вытеснению молекул красителя и снижению его участия в электронном обмене в слое. В результате удалось достичь предела обнаружения доксорубицина до 0.01 нМ. Не выявлено селективности сигнала в отношении других антрациклиновых препаратов, но их разделение возможно за счет различной скорости переноса в полимерную пленку. Впервые предложено замещение ДНК в составе гибридных материалов с полианилином после измерения антрациклиновых препаратов путем гидролитического разрушения и удаления ДНК из слоя действием соляной кислоты с последующим сорбционным замещением ДНК, не контактировавшей с аналитами. Удаление ДНК и регенерация покрытия были подтверждены с помощью спектроскопии электрохимического импеданса. Относительный вклад электростатических взаимодействий исследован с использованием полиэлектролитных комплексов с участием ДНК и синтетических полиэлектролитов (полиаллиламин, полидиметилдиаллиламмоний хлорид, полистиролсульфонат), сформированных на золоте, путем анализа поверхностного плазмонного резонанса. Установлено, что эффективность сборки полиэлектролитов зависит от гидрофильности и конформационной гибкости молекул поликатионов. Выявлены критерии разделения вклада нативной, денатурированной и окисленной ДНК по их влиянию на сигнал сенсора (сдвиг угла поверхностного плазмонного резонанса). Определено, что включение молекул доксорубицина в состав нативной ДНК снижает эффективность сборки полиэлектролитных комплексов за счет изменения жесткости и внутреннего объема молекул биополимера. Определена возможность разделения эффектов, связанных с интеркалированием и окислительным повреждением структуры ДНК, показана возможность регистрации защитного эффекта антиоксидантов, снижающих действие активных форм кислорода на ДНК. Проведено сравнение аналитических и операционных характеристик ДНК-сенсоров на основе полианилина и полимерной формы нейтрального красного с послойной иммобилизацией ДНК, полиаминированного производного тиакаликс[4]арена и полистиролсульфоната. Сигналом сенсора служило изменение сопротивления переноса заряда, устанавливаемое по данным спектроскопии электрохимического импеданса в присутствии феррицианид-ионов. Показано, что наибольшей чувствительностью определения антрациклиновых препаратов обладает сенсор на основе поли(нейтрального красного), предел обнаружения составил до 0.1 нМ препарата, селективности отклика в отношении структурно родственных антрациклинов не выявлено. Вклад полиаминированного тиакаликс[4]арена связан с экранированием молекул ДНК и обеспечением электростатической сборки противоположно заряженных компонентов комплекса. Сборка полиэлектролитов на слое поли(нейтрального красного) подтверждена с помощью сканирующей электронной микроскопии. Тионин и толуидин при электрополимеризации показали меньшую эффективность, чем нейтральный красный и анилин. Внесение ДНК в реакционную смесь незначительно влияло на вольтамперные характеристики покрытий. Нанесение ДНК поверх слоя полимера позволяет разделить нативную, денатурированную и окисленную формы биополимера по изменениям формы, положения и высоты пиков на вольтамперограммах. Показано снижение сопротивления переноса заряда политионина в присутствии ДНК и возможность разделения влияния интеркалирования и электростатических взаимодействий с ДНК по направлению изменения параметров импеданса и синхронности изменения сопротивления и емкости поверхностного слоя. Все разработанные ДНК сенсоры были протестированы на искусственных образцах, имитирующих биологические жидкости. Установлено, что мешающее влияние матрицы связано с высокой концентрацией низкомолекулярных электролитов, присутствием белков и неоптимальным рН. Предложены способы пробоподготовки, нивелирующие указанные факторы. Высокая чувствительность определения антрациклинов позволяет также разбавлять образцы с возможностью надежной регистрации диагностически значимых концентраций лекарственных препаратов. Степень открытия антрациклинов (на примере доксорубицина) составляет не менее 85%.

 

Публикации

1. - КФУ создаст ДНК-сенсоры для изучения силы противораковых лекарств РБК Татарстан, Татарстан, 08 июля 2017, 8:46 Автор: Альберт Насыров. (год публикации - ).

2. - Казанские ученые создают сенсоры по определению эффективности противораковых препаратов Медиа-портал КФУ, Тема: Новости институтов , 07.07.2017 (год публикации - ).

3. Иванов А.Н., Кузин Ю.И., Евтюгин Г.А. SPR Sensor based on polyelectrolyte complexes with DNA inclusion Sensors and Actuators, B:Chemical, -V.281.-P.574-581 (год публикации - 2019).

4. Куликова Т.Н., Порфирьева А.В., Шамагсумова Р.В., Евтюгин Г.А. Voltammetric Sensor with Replaceable Polyaniline-DNA Layer for Doxorubicin Determination Electroanalysis, -V.30.-I.10.- P. 2284-2292 (год публикации - 2018).

5. Порфирьева А.В., Шибаева К.С., Евтюгин В.Г., Якимова Л.С., Стойков И.И., Евтюгин Г.А. Электрохимический ДНК-сенсор на доксорубицин на основе полиэлектролитного комплекса и аминированного тиакаликс[4]арена Журнал аналитической химии, -Т.74.-№7.-С.1-9 (год публикации - 2019).


Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Рассмотрены особенности электрохимической полимеризации метиленового синего, Азура Б и тионина. Во всех случаях введение в раствор ДНК снижает эффективность полимеризации и количество полимера, накапливаемого на электроде. В случае поли(метиленового синего) ДНК меняет соотношение пиков окисления-восстановления полимерной и мономерной формы красителя в пользу первой. В случае тионина введение 0.05-0.5 мг/мл ДНК в раствор для полимеризации снижает токи пиков в 4-5 раз, а их ширина по шкале потенциалов удваивалась. Присутствие доксорубицина в концентрации до 100 нМ не влияло на процесс полимеризации и электрохимические характеристики политионина. Полимеризация метиленового синего и тионина оказалась нечувствительна к источнику ДНК. Предложены методики проведения полимеризации, позволяющие качественно разделять влияние образцов ДНК, повергнутых окислительной и температурной деградации. При полимеризации Азура Б на циклических вольтамперограммах присутствуют пики мономерной и полимерной форм. Токи закономерно увеличиваются с числом циклов сканирования потенциала. Установлены стехиометрия переноса электрона и ионов водорода в лимитирующей стадии процесса (2:1). Исследованы возможности постадийного получения гибридных покрытий с нанесением ДНК после электрополимеризации красителя. В случае политионина и поли(метиленового синего) сорбционное накопление ДНК не привело к существенному улучшению функций распознавания биоспецифических взаимодействий ДНК. Полимерное покрытие Азура Б оказалось более чувствительным к введению ДНК. Присутствие ДНК подавляло сигнал поли(Азура Б) на 50% в случае инкубирования и 70% - при протоколе высушивания - отмывания. Относительное изменение катодного тока пика поли(Азура Б) линейно зависело от логарифма концентрации ДНК с пределом обнаружения, отвечающим присутствию на электроде 0.43 фемтомоль ДНК. Последующее инкубирование биосенсора в растворе доксорубицина приводит к частичному восстановлению электрохимической активности полимера (предел обнаружения 0.07 нМ, 50% изменение при 3.7 нМ). Указанные значения соответствуют или превосходят аналитические характеристики аналогичных ДНК-сенсоров, полученных с использованием биохимических принципов анализа (аптамеры на доксорубицин, специфические антитела, прямое окисление доксорубицина на электроде с адсорбированной ДНК). Получены смешанные покрытия с включением ДНК между электрополимеризованным анилином и тиазиновыми красителями. Электрополимеризация анилина улучшает последующие условия регистрации электрохимических характеристик полимерных форм метиленового синего, метиленового зеленого и нейтрального красного за счет более высокой скорости переноса электрона и электростатических взаимодействий между отдельными компонентами слоя. Сорбционное накопление ДНК стабилизирует полуокисленную форму эмералдина, которая сохраняет электрохимическую активность в нейтральной среде. После этого ДНК закрывали слоем политиазинового красителя, который получали также в течение четырех циклов сканирования потенциала. Проведена оптимизация основных параметров получения слоя. Сканирующая электронная и атомно-силовая микроскопия подтвердили включение физически адсорбированной ДНК в состав слоя полианилина и последующее покрытие биополимера слоем политиазиновых красителей. Электрохимические свойства полученных гибридных покрытий были охарактеризованы, используя стандартные растворы антиоксидантов в интервале их концентраций от 1 мкМ до 1 мМ. Сигналы аскорбиновой кислоты, гидрохинона, и кверцетина сложным образом зависели от состава модифицирующего покрытия, рН и концентрации. Абсолютная высота пиков красителей закономерно уменьшалась с увеличением рН раствора вследствие изменения электропроводности подстилающей пленки полианилина. В кислой области увеличение концентрации аскорбиновой кислоты увеличивало ток окисления политиазина за счет химической регенерации восстановленной формы красителя. Катодный пик менялся в противоположном направлении. Абсолютное значение пиков уменьшалось в ряду поли(Нейтральный красный) > поли(Метиленовый синий) > поли(метиленовый зеленый), что отвечает изменению стандартного потенциала указанных соединений Расширен круг лекарственных препаратов противоракового действия, способных взаимодействовать с ДНК и регистрируемых электрохимически. Были выбраны акридиновые препараты – профлавин и акридиновый желтый. Сложность их изучения связана с тем, что они весьма слабо растворимы в воде, что исключает получение достоверных концентрационных зависимостей сигналов. Нами были исследованы условия их осаждения на электроде с последующей адсорбцией ДНК и регистрацией электрохимических характеристик, чувствительных к указанным биохимическим взаимодействиям. Образование полимерной пленки профлавина в многократном сканировании потенциала нашло подтверждение с помощью электрохимического варианта пьезокварцевого микровзвешивания. На золотом пленочном электроде регистрировали те же пики, что и на стеклоуглеродном электроде, однако на обратной ветви вольтампрограммы дополнительно был виде необратимый катодный пик восстановления оксидов золота, пропадающей с увеличением числа циклов сканирования потенциала. Было предложено проводить послойную иммобилизацию профлавина и ДНК в раздельных стадиях, меняя природу электролита. В указанных экспериментах сначала получали устойчивую пленку полипрофлавина, после чего электрод промывали и на его поверхность наносили раствор ДНК, Последующее измерение токов пика показало положительное влияние ДНК на анодные токи пика, увеличивающиеся на 15-20%. Катодные токи пика полипрофлавина в присутствии ДНК своей значения не меняли. Включение ДНК в пленку поверх слоя полипрофлавина нашло подтверждение в методе электрохимической спектроскопии импеданса. Сходные эксперименты были проведены на стеклоуглеродном электроде, покрытом углеродной чернью, для него исследование осаждения ДНК проводили с помощью дифференциально-импульсной вольтамперометрии. По сравнению с чистым стеклоуглеродом ток окисления увеличивался в 6 раз, так восстановления – в 3 раза. По результатам скрининга электрохимической активности аналогичные измерения были проведены с помощью акридинового желтого. Установлено влияние фонового электролита на эффективность полимеризации акридинового желтого и выявлен факт ускорения процесса в присутствии нитрат-ионов, проявляющийся для всех исследованных буферных систем и концентраций фонового электролита. Количество ДНК по данным пьезокварцевого микровзвешивания не зависит от концентрации в растворе, а определяется рН и количеством циклов сканирования потенциала на стадии полимеризации препарата. Присутствие ДНК снижало сопротивление переноса заряда на границе электрод – раствор и нивелировало значение токов окисления-восстановления поли(акридинового желтого). Также наблюдалось уменьшение разброса значений токов пика, максимальное для продукта полимеризации из фосфатного буферного раствора и минимальное – из трифторуксусной кислоты. Найденные закономерности в дальнейшем найдут применение при конструировании ДНК-сенсоров для определения препаратов противоракового действия и регистрации повреждения ДНК активными формами кислорода. Проведено сравнительное исследование электрохимических характеристик полианилина, полученного в присутствии поликатионных полиэлектролитов и ДНК. Влияние полиэлектролитов определяется их способностью к электростатическим взаимодействиям с ДНК. Если совокупный заряд молекулы ДНК превышает заряд полиэлектролита, молекулярные комплексы заряжены отрицательно, их влияние на электрополимеризацию анилина незначительно отличается от влияния ДНК меньшей концентрации. Увеличение абсолютной концентрации ДНК в реакционной смеси независимо от концентрации полиэлектролита при сохранении общего отрицательного заряда увеличивает разброс токов пика и снижает стабильность электрохимических сигналов на вольтамперограммах. Спектроскопия электрохимического импеданса установила снижение сопротивления переноса заряда в области низких концентраций ДНК и увеличение – при брутто-концентрации полимера, превышающей 0.1 мг/мл. Соотношение концентраций ДНК и полиэлектролита в наибольшей степени влияет на емкость, которая следует изменению формального заряда комплекса ДНК – полиэлектролит. В том случае, когда полиэлектролиты брали в большом избытке относительно ДНК, при их взаимодействии следовало ожидать образования катионных комплексов, влияние которых на полимеризацию будет во всех случаях отрицательным. Разработанные ДНК-сенсоры были протестированы на образцах искусственной плазмы крови, сыворотки крови и урины здоровых доноров. При определении доксорубицина не было установлено значимого различия в поведении чистого вещества и препаратов, производимых фармацевтическими кампаниями TEBA и LANS, содержащими дополнительно стабилизаторы (лактозу и маннол). Предложена простая пробоподготовка для снижения влияния компонентов биологической матрицы, включая смешение пробы с метанолом, отделение выпадающих белков с помощью ультрацентрифугирования и последующее разбавление образца рабочим буферным раствором до соотношения 1:10 для элиминирования влияния органического растворителя. Сенсоры на основе полианилина, ДНК и полимерных форм фенотиазиновых красителей, полученных путем электрополимеризации и сорбционного накопления ДНК, испытывали в классификации образцов чая по уровню их антиоксидантной емкости с помощью метода главных компонент (доля объясненной дисперсии 91.1%) и линейного дискриминантного анализа (100% успешность прогноза марки чая для пяти образцов, купленных в местной торговой сети). Выявлена корреляция между антиоксидантной емкостью чая по результатам кулонометрического титрования и результатами измерения нормализованных токов пика красителей.

 

Публикации

1. Куликова Т.Н., Порфирьева А.В., Воробьев В.В., Савельев А.А., Зиятдинова Г.К., Евтюгин Г.А. Discrimination of tea by the electrochemical determination of its antioxidant properties by a polyaniline - DNA - polyphenazine dye modified glassy carbon electrode Analytical Letters, - (год публикации - 2019).

2. Куликова Т.Н., Порфирьева А.В., Евтюгин Г.А., Хианик Т. Electrochemical DNA Sensors with Layered Polyaniline—DNA Coating for Detection of Specific DNA Interactions Sensors, 19, 3, 469 (год публикации - 2019).

3. Порфирьева А.В,, Воробьев В.В., Бабкина С.С., Евтюгин Г.А. Electrochemical Sensor Based on Poly(Azure B)-DNA Composite for Doxorubicin Determination Sensors, 19, 9, 2085 (год публикации - 2019).


Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Проведено сравнительное исследование условий формирования поверхностных слоев ДНК-сенсоров на основе углеродных наноматериалов (углеродная чернь, восстановленный оксид графена), медиаторов электронного переноса (серебро, фталоцианин кобальта, супрамолекуряные производные пирокатехина) с целью выявления оптимальных условий иммобилизации ДНК и измерения сигнала ДНК- сенсора в отношении повреждающих факторов и интеркаляторов. Определены условия нанесения медиаторов и их вклад в сигналы на вольтамперограммах до и после электрополимеризации фенотиазиновых красителей. Установлено влияние собственных редокс-пиков медиаторов на сигналы полимерных форм метиленового синего и тионина. Определены сочетания модифицирующих компонентов, обеспечивающие максимальный и наиболее устойчивый сигнал при иммобилизации ДНК. Выявлен вклад полиэлектролитов (хитозан и полиэтиленимин), стабилизирующих слои противоположно заряженных компонентов (ДНК и углеродные наноматериалы), но сохраняющих способность ДНК участвовать в биохимических взаимодействиях с низкомолекулярными агентами. Установлена возможность установления термического повреждения ДНК по ее влиянию на токи пика полимерных форм фенотиазинов на электроде. Показано, что в тех же условиях интеркалирование ДНК большого влияния на сигнал не оказывает. Это открывает путь к повышению селективности ДНК-сенсора при разделении вклада повреждения и интеркалирования ДНК в сложных матрицах. Исследовано поведение акридинового желтого G на электродах, модифицированных углеродной чернью, и выявлено влияние адсорбции на проявление его электрохимической активности. Установлено разнонаправленное влияние рН на пики окисления и восстановления акридинового желтого G в присутствии ДНК. Проведено сравнение сигнала акридинового желтого G при его нахождении в растворе и в адсорбированном состоянии на электроде. Определено участие хитозана в стабилизации слоя углеродная чернь (акридиновый желтый G) – ДНК. Показана возможность регистрации сигнала о присутствии ДНК в анализируемом растворе и определении интеркаляторов ДНК по вольтамперометрическому сигналу акридинового желтого G. Впервые предложен ДНК-сенсор на основе смешанного покрытия, полученного при сополимеризации Азура Б и профлавина на стеклоуглеродном электроде. Установлено участие обоих красителей в реакции сополимеризации путем отнесения пиков и сравнительного анализа электрохимических показателей переноса электрона и положения пиков индивидуальных красителей и их смеси. С помощью интегрирования циклических вольтамперограмм установлено изменение доминирующей формы полимера и лимитирующей стадии его образования при увеличении числа циклов сканирования потенциала. Образование полимера и его последующее взаимодействие с ДНК с образованием наноразмерных агрегатов было подтверждено с помощью сканирующей электронной микроскопии. Установлена устойчивость сигнала полученного биосенсора к антиоксидантам, включая те, которые применяются при стабилизации лекарственных форм (маннит, гидрохинон, лактоза). Это дает преимущество ДНК-сенсору при контроле качества лекарственных препаратов, а также при анализе биологических жидкостей, содержащих остаточные количества лекарств. Вместе с тем, разработанный биосенсор реагировал увеличением сопротивления переноса заряда в спектроскопии электрохимического импеданса на контакт ДНК с доксорубицином. Предел обнаружения препарата составил 0.01 нМ (интервал определяемых концентраций от 0.03 до 10 нМ). Показано, что влияние доксорубицина на параметры импеданса обусловлено увеличением сопротивления слоя диффузионному переносу лекарства, а не варьированию электростатических взаимодействий, как обычно в аналогичных ДНК-сенсорах. ДНК-сенсор был апробирован в измерении доксорубицина в искусственных образцах плазмы крови, растворе сывороточного альбумина. Определено минимальное разведение образца, достаточное для снятия влияния мешающих компонентов. Биосенсор отличается от аналогов более широкой рН-устойчивостью сигнала, независимостью отклика от присутствующих в образце электрохимически активных примесей, работой в нейтральной среде. Разработан ДНК-сенсор на основе электрополимеризованных модифицирующих покрытий и аптамера для определения микотоксинов (на примере афлатоксина М1). Выбор аналита связан с термической устойчивостью афлатоксина М1, который образуется в результате метаболического превращения афлатоксина В1 и выводится из организма коровы с молоком. Это приводит к опасности загрязнения указанным потенциально канцерогенным соединением молока и продуктов его переработки (кисломолочные изделия, сыры). Аптасенсор получали путем последовательного осаждения полианилина из раствора мономера в щавелевой кислоте и электростатической адсорбции специфического аптамера 5’- NH2-ACT GCT AGA GAT TTT CCA CAТ. Оптимизированы условия осаждения полианилина, количество аптамера и способ его иммобилизации. В частности, впервые предложено дополнительно покрывать аптамер сверхтонкой пленкой полианилина для его стабилизации и исключения мешающего влияния высокомолекулярных примесей. Инкубирование биосенсора в растворе аналита приводило к закономерному снижению сигналов окисления-восстановления полианилина. Изменение анодного тока пика линейно зависело от концентрации афлатоксина М1 в интервале 5 - 120 нг/л при инкубировании 60 мин. и 5-90 нг/л при инкубировании 20 мин. Пределы обнаружения составили 2 и 3 нг/л. В режиме измерения электрохимического импеданса увеличение концентрации афлатоксина М1 увеличивало сопротивление переноса заряда на границе биосенсор – раствор при сохранении постоянства емкости границы раздела. Изменение сопротивления внутренней границы раздела фаз линейно зависело от концентрации афлатоксина М1 в интервале 10-90 нг/мл, внешней границы раздела – 5-30 нг/л. Предел обнаружения, рассчитанный для соотношения сигнал/шум = 3, несущественно отличался от полученного ранее для вольтамперометрического определения (5 и 1нг/л, соответственно). Импедиметрический сигнал оказался более воспроизводимым, чем вольтамперометрический, и зависел от абсолютного значения концентрации аналита, а не ее логарифма. Установленные характеристики вольтамперометрического и импедиметрического определения афлатоксина М1 не уступают характеристикам аналогичных биосенсоров на основе аптамеров и специфических антител и превосходят их по простоте формирования биочувствительного слоя и продолжительности измерения. Аптасенсор показал селективность сигнала как в отношении других микотоксинов (афлатоксин В1 и охратоксин А), так и при замене аптамера на не селективный к афлатоксину М1. Все разработанные ДНК-сенсоры и аптасенсоры были опробованы на примере искусственных образцов биологических жидкостей, включая сыворотку крови и урину. Выявленная систематическая ошибка и увеличение погрешности измерения были отнесены к присутствию в пробах микронеоднородностей. Определены общие рекомендации по уменьшению влияния компонентов биологических жидкостей, включающие выбор оптимального разбавления, увеличение концентрации буферного раствора, адаптацию рН измерения. В целом вольтамперометрические измерения характеризуются меньшим значением погрешности определения, включая влияние на измерение мешающих компонентов анализируемых проб. Они же проще по исполнению и могут проводиться с использованием упрощенных анализаторов по типу оксиметров. Измерение электрохимического импеданса требует более высокой квалификации оператора и более чувствительно к биохимическим взаимодействиям ДНК. В большинстве рассмотренных вариантов конструирования биосенсоров импедиметрические системы регистрации сигнала одновременно показали и большую чувствительность к составу объекта анализа. На этом фоне выделяется сополимер Азура Б и профлавина, для которого импедиметрическая система оказалась менее чувствительной к компонентному составу пробы, чем аналоги с другими полимерными красителями.

 

Публикации

1. Куликова Т.Н., Порфирьева А.В., Евтюгин Г.А., Хианик Т. Electrochemical aptasensor with layer‐by‐layer deposited polyaniline for aflatoxin M1 voltammetric determination Electroanalysis, 31,10,1913-1924 (год публикации - 2019).

2. Порфирьева А.В., Гойда А.И., Рогов А.М., Евтюгин Г.А. Impedimetric DNA Sensor Based on Poly(proflavine) for Determination of Anthracycline Drugs Electroanalysis, 32, 4, 1-9 (год публикации - 2020).

3. Порфирьева А.В., Евтюгин Г.А. Electrochemical DNA sensor based on the copolymer of proflavine and Azure B for the doxorubicin determination Nanomaterials, Т.10, рег. № 924 (год публикации - 2020).


Возможность практического использования результатов
Разработанные ДНК-сенсоры могут найти применение в скрининге новых лекарственных препаратов противоракового действия, биологической мишенью которых является ДНК. Кроме того, они могут использоваться при назначении указанных препаратов больным с учетом особенностей их индивидуального выведения из организма. Аптасенсор на микотоксин М1 может найти применение в контроле продукции переработки молока (кисломолочные продукты, йогурты) на остаточное содержание токсина. Сенсоры на основе покрытий полианилин - ДНК - полифенотиазиновый краситель могут найти применение для контроля антиоксидантной емкости продуктов питания и напитков и их оценке по нечисловым показателям в рамках концепции "Электронный язык" (установление фальсификации, потери качества при ненадлежащем хранении, установление торговой марки и т.д.). Кроме того, протоколы полимеризации могут быть опробованы при конструировании электрохимических биосенсоров на основе других биорецепторов - иммуносенсоров, ферментных сенсоров на основе оксидоредуктаз.