КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 18-15-00357

НазваниеВыявление новых молекулярных мишеней для разработки патогенетической терапии FUS-протеинопатий: БАС и ФТЛД.

РуководительНинкина Наталья Николаевна, Доктор медицинских наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Федеральный исследовательский центр проблем химической физики и медицинской химии Российской академии наук, Московская обл

Период выполнения при поддержке РНФ 2018 г. - 2020 г. 

Конкурс№28 - Конкурс 2018 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами».

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины, 05-401 - Молекулярная и клеточная медицина

Ключевые слованейродегенеративные заболевания, агрегация белков, ДНК/РНК-связывающие белки, FUS, РНК-содержащие гранулы

Код ГРНТИ34.15.43


СтатусУспешно завершен


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
Проект посвящен изучению механизмов патогенной агрегации РНК-связывающего белка FUS при нейродегенерациях. Ранее мы показали, что накопление ядерного белка FUS в цитоплазме ведет к образованию нефункциональных РНП-гранул (FGs) и продуктов их слияния (FAs), которые могут являться предшественниками крупных патогистологичеких включений. FGs и FАs нарушают функционирование нормальных РНП-гранул (транспортных РНП-гранул, стресс-гранул, P-bodies и др.), захватывая определенные РНК и белки, что делает клетки менее устойчивыми к различным стрессорным воздействиям и, в конечном итоге, приводит к гибели поврежденных таким образом нейронов. Для того чтобы исследовать патологические каскады агрегации белка FUS нами было выполнено редактирование гена FUS в клетках нейробластомы человека с помощью технологии CRISPR/Cas9, что позволило удалить сигнал ядерной локализации и обеспечить накопление этого белка в цитоплазме. В результате было получено два типа клонов – в одних происходило образование атипичных форм РНП-гранул (FGs), а в других FUS распределялся в цитоплазме диффузно и не образовывал агрегатов. Эти две группы клонов представляют собой удобную модель для выявления эффекторных молекул и молекулярных каскадов, которые запускают или ингибируют образование патогенных гранул FGs, а так же для изучения нарушений в функционировании нейронов, вызванных накоплением FGs в их цитоплазме. Основной задачей проекта является выявление молекулярных механизмов патогенной агрегации белка FUS в цитоплазме и повреждающего эффекта такой агрегации на внутриклеточные процессы. Планируется провести сравнение транскриптомов двух полученных групп клеточных клонов и выявить мРНК, экспрессия которых различается в присутствие и отсутствие FGs, после чего изучить уровни кодируемых ими белков иммуноблотингом и иммуноцитохимией. Одной из задач проекта является разработка протокола выделения и очистки фракции гранул FGs, что позволит выявить специфические РНК и белки, захватываемые этими структурами. Эти результаты позволят выявить новые молекулярные мишени для разработки патогенетической терапии FUS-протеинопатий и иных типов нейродегенераций, вызываемых патологической агрегацией РНК-связывающих белков.

Ожидаемые результаты
На основании анализа результатов полногеномного секвенирования РНК (RNAseq) будет установлена представленность различных РНК в двух типах клеточных клонов нейробластомы человека – тех, которые образуют патогенные FUS-реактивные включения, и в тех, что не образуют включения даже при высокой концентрации диффузно распределенного белка FUS. На основании анализа методом RT-PCR в реальном времени уровней экспрессии мРНК, которые дифференциально представлены в образующих и не образующих патогенные включения клонах будут выявлены клеточные факторы, которые вовлечены в патогенную агрегацию белка FUS и/или могут влиять на формирование FUS-реактивных включений. Будет модифицирован протокол получения и очистки патогенных мелких FUS-содержащих гранул и на основании анализа РНК, выделенных из очищенных фракций мелких гранул будут выявлены транскрипты, специфичные для патогенных включений, образуемых белком (FGs). Будет получен ответ на один из основных вопросов в изучении механизма патогенной агрегации белка FUF – действительно ли захват патогенными гранулами определнных мРНК ведет к снижению их уровня и дефициту кодируемых ими белков. Будет исследована роль длинных некодирующих РНК (lncRNA) в процессах формирования и поддержания структуры цитоплазматических гранул, образуемых мислокализованным белком FUS. Будут описаны белки, захватываемые патогенными FUS-реактивными гранулами, и выявлены внутриклеточные процессы и метаболические пути, которые являются наиболее чувствительными к нарушению функции этих белков и, таким образом, будут определены новые молекулярные мишени для подавления прогрессии и патологических проявлений FUSпротеинопатии.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Аберрантной агрегации РНК-связывающих белков отводится важная роль в патогенезе нейродегенеративных заболеваний. Недавние исследования показали, что нарушение физико-химических свойств белков FUS и TDP43 ведет к инициации патогенных каскадов, которые обеспечивают образование нефизиологических РНК/белковых комплексов и приводит к образованию патогистологических включений. Такие включения при анализе аутопсийного материала выявляются в цитоплазме нейронов у больных с определенными формами бокового амиотрофического склероза (БАС) и фронтотемпоральной лобарной дегенерации (ФТЛД). Задачей проекта является изучение механизмов патогенной агрегации РНК-связывающего белка FUS и его роли в формировании нефункциональных РНП-гранул, которые, захватывая определенные РНК и белки, нарушают процессы формирования и функционирования физиологических РНП-гранул (транспортных РНП-гранул, стресс-гранул, P-bodies и др.), что делает клетки менее устойчивыми к различным стрессорным воздействиям и, в конечном итоге, приводит к гибели поврежденных таким образом нейронов. Для того чтобы моделировать и исследовать патологические каскады агрегации белка FUS, механизмы формирования патогенных FUS-содержащих включений, нами были созданы две клеточные линии на основе нейробластомы человека SH-SY5Y с редактированием гена FUS, которое обеспечило удаление сигнала ядерной локализации из белковой молекулы и накопление FUS в цитоплазме. Была получена клеточная линия с формированием патогенных цитоплазматических FUS-гранул (24-8) и линия с увеличенным содержанием белка FUS в цитоплазме, но при этом с его диффузным распределением (14-4). Было показано, в клеточных культурах 24-8 и 14-4 изменен ответ на окислительный стресс, индуцированный арсенитом натрия. В цитоплазме 24-8 и 14-4 клеток выявлено формирование нового типа FUS-содержащих включений, при этом и их морфология, и количество, и скорость накопления различны для клеток 24-8 и 14-4. Для выявления эффекторных молекул в каскадах, инициирующих и поддерживающих процессы патогенной агрегации белка FUS, было выполнено сравнительное исследование транскриптомов линий 24-8 и 14-4. Для этого в трех независимых выделениях была приготовлена РНК из клеток, прошедших одинаковое число пассажей в линиях 24-8 и 14-4, а также оригинальной линии нейробластомы SH-SY5Y, и проведен ее количественный и качественный анализ с использованием Qubit флуориметрии и в TapeStation. Из одинаковых стартовых количеств РНК были подготовлены кДНК библиотеки с помощью Illumina TruSeq Stranded mRNA наборов. После нормализации кДНК эти библиотеки были секвенированы в Illumina NextSeq 500. На первой стадии анализа образцы были проанализированы на одном сиквенсном картридже, а после нормализации и учета числа ридов - на втором. Были выявлены пулы РНК, экспрессия которых различалась в культурах, формирующих FUS-реактивные патогенные включения и не формирующие их. STRING анализ кодируемых этими мРНК белков позволил обнаружить группы функционально связанных белков с повышенной или пониженной продукцией в клетках, содержащих FUS-гранулы. В клеточной линии с формированием FUS-гранул (24-8) повышена продукция белков-шаперонов: Hspb1, Hspa5, Dnajb11, Dnajc3. В этой же линии активирована экспрессия пула мРНК, кодирующих белки внутриклеточных сигнальных каскадов, в первую очередь протеинкиназ: Mapk4, Pi3kr1, Prkce, Sgk3, Flt1. Среди белков с пониженной продукцией в клетках, формирующих FUS-гранулы, представлены транскрипционные факторы: Egr1, Atf4, Fos, Junb, Creb3 и регулирующие их активность белки внутриклеточных сигнальных каскадов: Rps6ka4, Smad2. В группе транскрипционных факторов были особо выделены белки, участвующие в регуляции циркадных ритмов: Per2, Per3, Cry1, Dbp. Для выявления роли длинных некодирующих РНК NEAT1 и MALAT1 в формировании и обеспечении стабильности патогенных FUS-содержащих гранул были выполнены эксперименты с ингибированием экспрессии NEAT1 в культивируемых клетках 24-8 с помощью специфических siRNAs (Silencer Select®, n272456) и параллельно в контрольных культурах – неспецифические короткие РНК (AllStars from Qiagen). Анализ количества и структуры FUS-реактивных патогенных гранул в цитоплазме клеток 24-8 показал изменение морфологии и плотности FUS-реактивных включений при блокировке гена NEAT1. Таким образом, получена уникальная клеточная модельная система для выявления эффекторных молекул и путей, инициирующих или подавляющих образование патогенных гранул. Кроме того, данная модельная система позволяет изучать внутриклеточные каскады, обеспечивающие образование и распространение патогенных включений, а также механизмы повреждения нейронов, в которых задействованы атипичные FUS-содержащие гранулы, которым отводится ключевая роль в ряде форм БАС и ФТЛД.

 

Публикации

1. Лысикова Е.А., Чапров К.Д., Иванова Т.А., Устюгов А.А., Овчинников Р.К., Кухарский М.С., Коршунов Е.А., Дейкин А.В., член-корр.РАН Бачурин С.О., Нинкина Н.Н. Нарушение когнитивной функции у трансгенных мышей со сниженным уровнем экспрессии патогенной формы белка FUS человека Патогенез. Статья находиться на втором раунде рецензирования после ответов рецензенту., - (год публикации - 2019)

2. Скворцова В.И., Бачурин С.О., Устюгов А.А., Кухарский М.С., Дейкин А.В., Бухман В.Л., Нинкина Н.Н. Перспективы использования гамма-карболинов для разработки патогенетической терапии протеинопатий ACTA NATURAE, Номер 4, Том 10, Стр. 54-57 (год публикации - 2018)

3. Шелковникова Т.А., Кухарский М.С., Ан Х., Димаси П., Алексеева С., Сабир О., Хеас П.Р., Бухман В.Л. Protective paraspeckle hyper-assembly downstream of TDP-43 loss of function in amyotrophic lateral sclerosis Molecular Neurodegeneration, Номер 1, Том 13, Стр. 30 (год публикации - 2018) https://doi.org/10.1186/s13024-018-0263-7


Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Большинство мутаций в гене FUS, ассоциированных с развитием бокового амиотрофического склероза (БАС), располагается в участке, советующем сигналу ядерной локализации данного белка. Для моделирования такой патологической ситуации нами были получены линии клеток SH-SY5Y с удаленным участком гена, кодирующем 12 C-концевых аминокислот в белке FUS с помощью технологии редактирования CRISPR/Cas9. В клетках с аберрантным белком FUS наблюдалось накопление транскриптов длинной некодирующей РНК NEAT1 и, как следствие, образование на их основе внутриядерных структур - параспеклов. Однако несмотря даже на незначительное патологическое перераспределение белка FUS в цитоплазму нарушалось функциональное состояние образующихся параспеклов, что подтверждалось снижением взаимодействия аберрантного FUS и ключевых белков параспеклов NONO и SFPQ. Это приводило к накоплению NEAT1 вне параспеклов, особенно при стрессовых условиях, требующих формирования параспеклов. Параллельно проводилось моделирование схожих патологических процессов в условиях in vivo в трансгенных мышиных линиях. Линия трансгенных мышей tg_hFUS[1-359], обозначаемой так же S-FUS[1-359], в геноме которых экспрессируется трансгенная кассета, кодирующая аберрантную форму белка FUS человека с удаленным сигналом ядерной локализации и нарушенным РНК-связывающим доменом, широко применяется для изучения бокового амиотрофического склероза (БАС). В серии обратных скрещиваний мышей S-FUS[1-359] с переводом на генетический фон CD1 была выделена линия животных L-FUS[1-359] с увеличенной продолжительностью жизни и отсутствием клинической симптоматики БАС. Был проведен анализ копийности трансгенной кассеты в геноме L-FUS[1-359] мышей, который показал, что число копий не изменилось по сравнению с оригинальной линией S-FUS[1-359]. Анализ экспрессии трансгена в нервной системе показал, что у L-FUS[1-359] мышей она на порядок ниже, чем у S-FUS[1-359]. Такой уровень экспрессии трансгена оказался достаточным, для синтеза детектируемых количеств патогенной формы белка FUS (55 кДа) человека в нейронах L-FUS[1-359] мышей. У животных линии L-FUS[1-359] было выявлено снижение содержания формы 55 кДа в спинном мозге и увеличение в коре головного мозга по сравнению с S-FUS[1-359]. Хромосомный анализ показал, что у оригинальной линии tg_hFUS[1-359] имело место встраивание трансгенной кассеты в геном на 11 хромосоме, в то время как у животных линии L-FUS[1-359] трансгенная кассета картировалась на 12 хромосоме. По-видимому, это являлось результатом транслокации локуса FUS, поскольку подобные транслокации с участием локуса FUS описаны у пациентов с различными патологиями, например, миелоидными лейкемиями и миксоидной липосаркомой. Изменение локализации трансгенной кассеты в геноме L-FUS[1-359] мышей привело к снижению уровня ее транскрипции, и утрате фенотипа БАС. Несмотря на то, что в тканях спинного мозга L-FUS[1-359] мышей сохранялась экспрессия патогенной формы FUS человека и накапливался аберантный белок FUS в цитоплазме двигательных нейронов, у них отсутствовали признаки двигательной дисфункции и был утерян фенотип БАС. Морфометрический анализ двигательных нейронов спинного мозга L-FUS[1-359] мышей не выявил ни потери нейронов, ни признаков их дегенерации даже у стареющих животных. Тогда как наибольшее накопление белка отмечалось в цитоплазме крупных нейронов V слоя коры головного мозга. При этом и в цитоплазме корковых нейронов, и в цитоплазме двигательных нейронах спинного мозга L-FUS[1-359] мышей распределение патогенной формы FUS так же было диффузным без признаков формирования белковых агрегатов. На основании полученных данных нами было выдвинуто предположение, что при медленно текущей FUS-протеинопатии и увеличенной продолжительности жизни животных линии L-FUS[1-359] имеется достаточный отрезок времени для прогрессии патологических каскадов, ведущих к повреждению нейронов коры головного мозга и развитию когнитивных расстройств. В батарее классических поведенческих тестов, был проведен анализ когнитивной функции стареющих L-FUS[1-359] мышей. Совокупность выявленных изменений, включающих снижение тревожного состояния, увеличение импульсивности, нарушения формирования и угасания долговременной памяти, а так же снижение социальных взаимодействий свидетельствовали об эмоциональных нарушениях, которые характерны для больных с ФТД, что позволило рассматривать линию L-FUS[1-359] в качестве новой трансгенной модели ФТД. Чтобы выявить собственные защитные механизмы в двигательных нейронах L-FUS[1-359] мышей, которые задействованы в успешном подавлении FUS-протеинопатии, был начат сравнительный анализ транскриптомов тканей спинного мозга молодых L-FUS[1-359] мышей и контрольных мышей дикого типа. В целях популяризации результатов проекта была опубликована научно-популярная статья в журнале «Популярная механика», ссылка на статью: https://www.popmech.ru/science/482571-odna-malenkaya-pobeda-v-voyne-s-samym-strashnym-vragom-chelovechestva/#part0

 

Публикации

1. Ан Х., Скелт Л., Нотаро А., Хайли Дж.Р., Фокс А.Х., Ла Белла В., Бухман В.Л., Шелковникова Т.А. ALS-linked FUS mutations confer loss and gain of function in the nucleus by promoting excessive formation of dysfunctional paraspeckles Acta Neuropathologica Communications, Volume 7, Issue 1, Page 7 (год публикации - 2019) https://doi.org/10.1186/s40478-019-0658-x

2. Лысикова Е.А., Кухарский М.С., Чапров К.Д., Васильева Н.А., Роман А.Ю., Овчинников Р.К., Дейкин А.В., Нинкина Н.Н., Бухман В.Л. Behavioural impairments in mice of a novel FUS transgenic line recapitulate features of frontotemporal lobar degeneration GENES BRAIN AND BEHAVIOR, Volume 18, Issue 8, Номер статьи e12607 (год публикации - 2019) https://doi.org/10.1111/gbb.12607

3. Лысикова Е.А., Чапров К.Д., Иванова Т.А., Устюгов А.А., Овчинников Р.К., Кухарский М.С., Коршунов Е.А., Дейкин А.В., член-корр.РАН Бачурин С.О., Нинкина Н.Н. Нарушение когнитивной функции у трансгенных мышей со сниженным уровнем экспрессии патогенной формы белка FUS человека. Патогенез, Том 17, № 1, Стр. 41-49. (год публикации - 2019) https://doi.org/10.25557/2310-0435.2019.01.41-49

4. Нинкина Н.Н., Кухарский М.С., Хьюитт М.В., Лысикова Е.А., Скуратовская Л.Н., Дейкин А.В., Бухман В.Л. Stem cells in human breast milk Human Cell, Volume 32, Issue 3, Pages 223-230 (год публикации - 2019) https://doi.org/10.1007/s13577-019-00251-7

5. Кухарский M.C., Шелковникова T. Потеря функции белка TDP-43 активирует сборку параспеклов при боковом амиотрофическом склерозе ActaNaturae, СПЕЦВЫПУСК 2019 том 2 стр. 185 (год публикации - 2019)

6. Лысикова Е.А. Трансгенная линия мышей с медленно прогрессирующей FUS-протеинопатией как модель фронто-темпоральной дегенерации. Электронный сборник «Актуальные проблемы биомедицины-2019: Материалы XXV Всероссийской конференции молодых учёных с международным участием», стр.131-133 (год публикации - 2019)

7. Лысикова Е.А., Нинкина Н., Буxман В.Л. Behavioural impairments in transgenic mice expressing C-terminally truncated human FUS. ENCALS meeting. 2019 May 15-17, Tours, France. Book of abstracts., page 48, abstract № 1922 (год публикации - 2019)

8. Чапров К.Д., Сорокин В.В., Иванова Т.А. Метод характеристики прогрессии FUS-протеинопатии на пресимптоматической стадии у трансгенных мышей для тестирования нейропротекторных соединений. ActaNaturae, СПЕЦВЫПУСК 2019 том 2 стр. 230 (год публикации - 2019)

9. - О мышах и генах: история одной маленькой победы в войне с самым страшным врагом человечества ООО «Фэшн Пресс» журнал «Популярная механика», в сети «Интернет» - 26 мая 2019 10:00 №6 (200), Июнь 2019; в печатной версии - 26 мая 2019 10:00 в журнале «Популярная механика» (№6 (200), Июнь 2019) с.72-73 (год публикации - )


Аннотация результатов, полученных в 2020 году
В 2020 году было завершено исследование молекулярных механизмов, вовлеченных в подавление нейродегенеративного процесса в нейронах спинного мозга, вызванного FUS-протеинопатией. В работе была использована созданная нами ранее модель медленно прогрессирующией FUS-протеинопатии с относительно низким уровнем эктопической нейроспецифической экспрессии патогенной формы белка FUS человека – линия трансгенных мышей L-FUS[1-359]. Сравнение транскриптомов, полученных методом полногеномного сиквенирования РНК из тканей спинного мозга L-FUS[1-359] мышей и мышей дикого типа в возрасте 60 дней, позволило выявить группы генов, экспрессия которых изменялась при компенсированной FUS-протеинопатии. Биоинформационный анализ генетических онтологий дифференциально экспрессирующихся генов был проведен совместно с ИМБ РАН. Были определены белки, кодируемые этими генами и установлены потенциальные молекулярные каскады, обеспечивающие эффективное подавление FUS-протеинопатии в нейронах спинного мозга L-FUS[1-359] мышей. Самую многочисленную группу составляли гены клеточной адгезии и актинового цитоскелета, гены циркадных ритмов, гены белков внеклеточного матрикса: клаудин-19 (Cldn19), тенасцин XB (Tnxb), стабилин 1 (Stab1), фактор клеточной адгезии (Bcam), коллагены (Col14a1, Col15a1, Col18a1), коллаген-связывающие белки (Tgfbi, Nid2), семафорины (SEMA3G, SEMA4B, SEMA5A) и некоторые другие гены данных семейств. Биоинформационный анализ показал, что повышение уровня экспрессии наблюдалось среди контролирующих циркадные ритмы генов-паралогов транскрипционных факторов period (Per1, Per2, Per3), генов-репрессоров факторов, регулирующих транскрипцию циркадных генов (CIART, BHLHE40) и гена фактора транскрипции (DBP), тогда как экспрессия генов, кодирующих активаторы транскрипции циркадных генов (ARNTL, NPAS2), была снижена. Таким образом, было установлено, что экспрессия патогенной формы белка FUS человека в нейронах L-FUS[1-359] трансгенных мышей, вызывает изменения в сложном механизме регуляции циркадных ритмов по типу обратной связи. Важным результатом для установления патогенетических механизмов при компенсированной FUS-протеинопатии было выявление изменений в экспрессии генов транскрипционныx факторов (SOX2, OLIG2), играющих ключевую роль в дифференцировке нейрональных клеток и детерминации моторных нейронов – их экспрессия была достоверно снижена в спинном мозге животных L-FUS[1-359]. Экспрессия генов, кодирующих белки шапероны и шаперонины (Hspa2, Hsp90b1, Dnajb11, Cryab, Mkks), протеин-дисульфидные изомеразы (Pdia4, Pdia6) и Са2+-связывающий белок (Calr) также была снижена. Активированы гены актин-связывающих белков, (Flna, Coro6, Diaph, Ermn), миозина (Myh11) и белков-компонентов динеинового комплекса (Dync1i1, Dynll1, Dnaic1, Dnah8). Для подтверждения данных транскриптомного анализа были выбраны гены с наибольшим увеличением или снижением уровней экспрессии. Те же образцы РНК, что были использованы для синтеза кДНК библиотек транскриптов, использовались и качестве матриц в реакции ОТ-ПЦР в реальном времени. Было подтверждено многократное повышение уровня экспрессии гена MPZ (в 6 раза), кодирующего трансмембранный гликопротеин, составляющий 50% структуры периферической миелиновой оболочки, и гена Prx (в 4 раза), кодирующего белок, две изоформы которого в комплексе с другими белками участвуют в образовании миелиновой оболочки. Наиболее выраженное снижение уровня экспрессии было подтверждено для гена FGGY (в 7 раз), кодирующего карбогидраткиназу, которая участвует в энергетическом метаболизме клетки и в процессах гликолиза, а мутации в этом гене ассоциированы со спорадическими случаями бокового амиотрофического склероза. Для гена GRP179, кодирующего рецептор, сопряжённый с G-белком, было подтверждено снижение уровня экспрессии (в 2 раза) в спинном мозге L-FUS[1-359] мышей. При этом уровень экспрессии гена PPARA, выбранного в качестве контрольного, не была изменена ни в реакции ОТ-ПЦР, ни при полногеномном сиквенировамии транскриптомов спинного мозга L-FUS[1-359] мышей. Таким образом, была проведена идентификация маркерных белков из каскадов, которые могут быть вовлечены в защитные механизмы, участвующие в подавлении прогрессии FUS-протеинопатии в двигательных нейронах. Это имеет важное научно-практическое значение для разработки патогенетической терапии FUS-протеинопатий. Возможность активации собственных защитных механизмов через регуляцию соответствующих молекулярных каскадов позволит разработать новую стратегию лечения БАС, базирующуюся на воздействии на ключевое звено патогенеза заболевания путем замедления или даже полного подавления прогрессии FUS-протеинопатии. Животная модель FUS-протеинопатии FUS[1-359] была использована для поиска синтетических соединений, способных активировать собственные каскадные механизмы, обеспечивающие защиту двигательных нейронов от патогенных белков с нарушенной конформацией. Было проведено тестирование трех мультикомплексных соединений на их способность подавлять прогрессию нейродегенеративного процесса у FUS[1-359] мышей. Статистически значимые показатели модуляции модельного заболевания были выявлены только для включающего гамма-карболиновый домен биоизостера димебона DF412. Администрирование DF402 увеличивало продолжительность жизни FUS[1-359] мышей на 13% за счет отсроченного дебюта модельного заболеванияи удлинения продромальной стадии в среднем на 11% и увеличения выживаемости животных в симптоматической стадии, которая протекала на 24% дольше, чем в контрольной группе животных, не получавших препарат. Для оценки двигательной функции животных в продромальном периоде FUS-протеинопатии был проведен анализ походки мышей в установке CatWalk XT (Noldus, Нидерланды). Анализ 177 параметров выявил отличия по 128 показателям походки у FUS[1-359] мышей уже в возрасте 10 недель. Это позволило разработать протокол для количественной оценки ухудшения или улучшения двигательной финкции у FUS[1-359] мышей на основе инструментального анализа походки. Администрирование соединения DF402 корректировало походку по 31 параметру: статистически достоверные изменения 8 параметров были выявлены уже на ранней пресимптоматической стадии (за 15-25 дней до начала клинической симптоматики нейродегенеративного процесса в двигательных нейронах), еще 19 параметров - на средней пресимптоматической стадии (за 8-14 дней до начала клинической симптоматики) и 16 параметров непосредственно перед дебютом. Разработанный протокол позволяет исследовать эффективность действия новых тестируемых препаратов на двигательную функцию в продромальном периоде FUS-протеинопатии. Для выявления молекулярных механизмов которые активируются или подавляются в двигательных нейронах под действием DF402, было выполнено полногеномное сиквенирование РНК, выделенной из спинного мозга молодых FUS[1-359] мышей, получавших DF402 в течение 5 недель, начиная с возраста 5 недель. Анализ транскриптомов выявил изменения в уровне экспрессии 171 гена, были установлены кодируемые ими белки. 64% дифференциально экспрессирующихся генов (ДЭГ) были нейроспецифическими или преимущественно экспрессировались в нейронах. Интересно, что изменения уровней экспрессии в нейронах FUS[1-359] мышей под действием DF402 наблюдались в сторону “нормализации” и стремились к уровням, которые для данных генов характерны в транскриптомах мышей дикого типа. Для количественной оценки компенсаторного эффекта, вызванного введением DF-402, был рассчитан коэффициент компенсации, который для более чем половины ДЭГ составил от 40 до 100 % ( 100% означает полное соответствие уровню экспрессии в нейронах контрольных мышей дикого типа). Проведенный анализ позволил получить предварительные данные о молекулярных каскадах, которые модулируюся соединением DF-402 в нейронах спинного мозга FUS[1-359] мышей, и оценить возможности его дальнейшего использования при разработке перспективных лекарственных средств, способных подавлять прогрессию дегенерации двигательных нейронов при FUS-протеинопатиях.

 

Публикации

1. Головин А.В., Девред Ф., Ятоуи Д., Роман А.Ю., Залевский А.О., Пуппо Р., Лебрюн Р., Герлескин Ф., Цветков Ф.О. Zinc Binds to RRM2 Peptide of TDP-43 International Journal of Molecular Sciences, 21(23), 9080 (год публикации - 2020) https://doi.org/10.3390/ijms21239080

2. де Мюнтер Ю., Бабаевская Д., Вольтерс Э.С., Павлов Д., Лысикова Е., Калуев А.В., Горлова А., Оплатчикова М., Помыткин И.А., Прошин А., Умрюхин А., Леш К.П., Стрекалова Т. Molecular and behavioural abnormalities in the FUS-tg mice mimic frontotemporal lobar degeneration: Effects of old and new anti-inflammatory therapies Journal of Cellular and Molecular Medicine, Том: 24 Выпуск: 17 Стр.: 10251-10257 (год публикации - 2020) https://doi.org/10.1111/jcmm.15628

3. Лысикова Е.А., Фуников С., Резвых А.П., Чапров К.Д., Кухарский М.С., Устюгов А., Дейкин А.В., Флямер И.М., Бойл С., Бачурин С.О., Нинкина Н., Бухман В.Л. Low level of expression of C-terminally truncated human FUS causes extensive changes in the spinal cord transcriptome of asymptomatic transgenic mice Neurochemical Research, Volume 45, Issue 5, Pages 1168-1179 (год публикации - 2020) https://doi.org/10.1007/s11064-020-02999-z

4. Нинкина Н. Stem cell therapy and FUS[1-359]-transgenic mice: A recent study highlighting a promising ALS model and a promising therapy CNS Neuroscience and Therapeutics, Volume 26, Issue 5, Pages 502-503 (год публикации - 2020) https://doi.org/10.1111/cns.13302

5. Кухарский М.С., Скворцова В.И., Бачурин С.О., Бухман В.Л. In a search for efficient treatment for amyotrophic lateral sclerosis: Old drugs for new approaches Medicinal Research Reviews, Стр.: 1‐19 (год публикации - 2020) https://doi.org/10.1002/med.21725

6. - Ученые узнали о механизме, который защищает мозг от болезни Стивена Хокинга ТАСС, информационное агентство, Федеральное государственное унитарное предприятие «Информационное телеграфное агентство России (ИТАР-ТАСС)», в сети «Интернет» - 3 апреля 2020 14:12 (год публикации - )

7. - Малые количества патогенного белка включили естественную защиту нейронов в модели бокового амиотрофического склероза Indicator.Ru — информационно-сервисный портал, Учредитель: ООО «Лента.Ру», в сети «Интернет» - 4 апреля 2020 14:49 (год публикации - )

8. - Ученые включили естественную защиту нейронов в модели бокового амиотрофического склероза Газета.Ru (Gazeta.Ru), Учредитель: АО «Газета.Ру», в сети «Интернет» - 3 апреля 2020 21:03 (год публикации - )

9. - Российские ученые открыли механизм, защищающий мозг от «болезни Стивена Хокинга» Информационный Портал «Будущее России. Национальные проекты», оператором которого выступает ТАСС, информационное агентство, Федеральное государственное унитарное предприятие «Информационное телеграфное агентство России (ИТАР-ТАСС)», в сети «Интернет» - 3 апреля 2020 13:19 (год публикации - )

10. - Малые количества патогенного белка включили естественную защиту нейронов в модели бокового амиотрофического склероза «ХимРар» Высокие Технологии, ЦВТ "ХимРар", в сети «Интернет» - 6 апреля 2020 (год публикации - )

11. - Ученые включили естественную защиту нейронов в модели бокового амиотрофического склероза Сайт Российского научного фонда (rscf.ru) перепечатка с Газета.Ru (Gazeta.Ru), в сети «Интернет» - 7 апреля 2020 15:01 (год публикации - )

12. - Для человеческой деменции создали мышиную модель Наука и жизнь (Сайт nkj.ru), в сети «Интернет» - 17 августа 2020 (год публикации - )

13. - Новая мышиная модель помогла разработать метод лечения деменции Indicator.Ru — информационно-сервисный портал, Учредитель: ООО «Лента.Ру», в сети «Интернет» - 14 августа 2020 в 18:08 (год публикации - )

14. - Российские мыши помогли искать лекарство от деменции Газета.Ru (Gazeta.Ru), Учредитель: АО «Газета.Ру», в сети «Интернет» - 14 августа 2020 в 17:13 (год публикации - )

15. - Российские мыши помогли искать лекарство от деменции Сайт: doctor.rambler.ru, Владелец: Rambler Group, в сети «Интернет» - 14 августа 2020 (год публикации - )

16. - Трансгенные мыши из России помогут лечить деменцию. Ученые применили мышиную модель для разработки нового подхода к лечению ранней стадии заболевания Сайт health.mail.ru, Издается ООО «Мэйл.Ру», в сети «Интернет» - 21 августа 2020 (год публикации - )

17. - Ученые применили созданную в России мышиную модель для разработки нового подхода к лечению ранней деменции Сайт poisknews.ru, Сетевое издание Научно-информационный портал «Поиск» / Science information portal Poisk, Учредитель: Общество с ограниченной ответственностью «ТМК Брэнд», в сети «Интернет» - 17 августа 2020 (год публикации - )


Возможность практического использования результатов
1. Была разработана модельная система на основе двух новых клеточных линий, полученных путем редактирования гена FUS в клетках нейробластомы человека SH-SY5Yс помощью CRISPR/Cas9 технологии. Модельная система позволяет изучать внутриклеточные каскады, обеспечивающие образование и распространение патогенных включений, а также механизмы повреждения нейронов, в которых задействованы атипичные FUS-содержащие гранулы. В патогенезе целого ряда форм БАС и ФТЛД именно им отводится ключевая роль. 2. Получена новая линия трансгенных мышей с медленно прогрессирующей FUS-протеинопатией, воспроизводящая основные характеристики фронтотемпоральной дегенерации (ФТД), которая может быть использована для исследования патогенеза ФТД и отбора болезнь-модифицирующих соединений.