КАРТОЧКА
ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ
Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.
ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ
Номер 18-73-10156
НазваниеРазработка высокоактивных соединений против резистентных форм туберкулеза с новым механизмом действия
РуководительРубцов Александр Евгеньевич, Кандидат химических наук
Организация финансирования, регион Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Пермский государственный национальный исследовательский университет", Пермский край
Период выполнения при поддержке РНФ | 07.2018 - 06.2021 | , продлен на 07.2021 - 06.2023. Карточка проекта продления (ссылка) |
Конкурс№30 - Конкурс 2018 года по мероприятию «Проведение исследований научными группами под руководством молодых ученых» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными.
Область знания, основной код классификатора 03 - Химия и науки о материалах, 03-103 - Синтез, строение и свойства природных и физиологически активных веществ; медицинская химия и прогнозирование различных видов биоактивности
Ключевые словатуберкулез, терпены, асимметрический синтез, микобактерии
Код ГРНТИ31.23.17
СтатусУспешно завершен
ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ
Аннотация
Проект направлен на поиск новых высокоэффективных противотуберкулезных веществ. Ранее было установлено, что терпены, выделенные из морских организмов, обладают рядом ярко выраженных антибактериальных свойств. Было показано, что разработанное нами новое производное дитерпена ергорджина проявляет высокую антимикобактериальную активность, в том числе по отношению к штаммам, резистентным к известным антибактериальным препаратам. Осуществленные нами предварительные исследования показали, что механизм воздействия этого вещества на микобактерии кардинально отличается от механизма воздействия существующих лекарственных преператов, применяемых в клинической практике. Более того, было установлено, что найденное соединение вызывает нарушение возможности персистообразования, являющегося ключевым фактором резистентности. Полученные нами результаты являются прорывными, не имеющими аналогов, поэтому требуют дальнейшего углубленного изучения.
В ходе выполнения проекта планируется провести эксперименты по углубленному исследованию механизма воздействия активного вещества на микобактерии и рассмотреть возможности комбинированного действия с другими существующими препаратами. Планируется синтезировать ряд аналогов уже имеющегося вещества и провести скрининг на наличие активности в отношении M. Tuberculosis.
В процессе решения главной практической задачи проекта, а именно создания терапевтического препарата против туберкулеза с новым механизмом действия, отличающимся от используемых в медицинской практике лекарств, планируется решить ряд задач практического и фундаментального характера. В частности, прежде всего будут созданы новые стратегические подходы и методы органического синтеза, а также разработаны новые методики для микробиологических исследований, которые будут пригодны для использования в других исследовательских задачах. Актуальность предполагаемого исследования для РФ и мирового сообщества в целом наиболее четко была сформулирована в речи президента РФ В.В. Путина:
«По оценкам экспертов, сегодня туберкулёзом инфицировано – просто страшно называть эту цифру – около трети населения планеты. …. Хотел бы сообщить, что снижение смертности от туберкулёза входит у нас в число государственных приоритетов – наравне со снижением смертности от сердечно-сосудистых заболеваний и от онкологических заболеваний. …. Вместе с тем для того, чтобы добиться коренного перелома в борьбе с этой болезнью, необходимы, безусловно, новые подходы как на национальном, так и на международном уровне, совместная работа правительственных структур, общественных, профессиональных организаций. …. Другим важным фактором успеха является интенсификация научных исследований в области туберкулёза, разработка эффективных средств диагностики, вакцин, лекарств, в том числе направленных на лечение устойчивых к существующим препаратам форм туберкулёза.» Из выступления Президента Российской Федерации В.В. Путина от 16 ноября 2017 года 14:00 Москва (http://www.kremlin.ru/events/president/news/56107)
Важно отметить, что предлагаемый исследовательский проект является весьма инновационным, поскольку он создает новые знания в междисциплинарной науке и решает важные практические проблемы
Ожидаемые результаты
В ходе реализации предложенного проекта планируется получение следующих основных результатов:
1. Будет найдено вещество, обладающее противомикобактериальной активностью в отношении устойчивых к антибиотикам штаммов и установлен механизм его действия, принципиально отличающийся от известных лекарств. До сих пор средства, обладающие бактерицидным действием в отношении персисторных форм микобактерий, не разработаны, и, соответственно, невозможность их использования в клинической противотуберкулезной практике не позволяет снизить высокий уровень смертности от этой инфекции. Таким образом, полученный результат будет иметь не только важное научное значение для мировой научной общественности в области медицинской микробиологии, но и позволит приблизится к решению практических задач, направленных на борьбу с туберкулёзом. Помимо этого, при успешном развитии результатов, проект может иметь неплохой экономический эффект в виде производства и реализации востребованного лекарственного препарата.
2. Будет разработан метод скрининга по уровню экспрессии гена, кодирующего белoк-мишень, и признакам ингибирования его активности. Реализация данного результата в будущем позволит упростить поиск новых антимикобактериальных веществ, действующих по аналогичному механизму, что важно как для фундаментальных исследований, так и для прикладных исследований в области разработки новых противотуберкулезных препаратов, и позволяет сократить временные и финансовые затраты.
3. Будут разработаны новые методологии органического синтеза, открывающие доступ к коротким синтезам необходимых соединений. В частности, разработанные схемы построения дитерпенов морского происхождения позволят осуществлять полный синтез необходимых структур, для которых найден широкий спектр биологической активности, но которые в силу малой доступности остаются малоизученными. Разработанные методы асимметрического синтеза также облегчат синтез веществ с заданной стереоконфигурацией атомов.
Таким образом, будут получены результаты мирового уровня, представляющие интерес как с точки зрения фундаментальной науки, так и с точки зрения практического применения
ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ
Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Синтезированы стереоизомеры исследуемых веществ в энантиообогащенном виде, а также ряд структурных аналогов. Разработан и осуществлён синтез ключевых хиральных интермедиатов для альтернативных методов ергорджина. Осуществлено энзиматическое кинетическое расщепление рацемического мелоналя (±)-5 с выделением энантиообогащенного продукта. Осуществлен стереоселективный синтез каламменена, являющегося упрощенной моделью эрогорджина. В процессе синтеза отработаны ключевые стадии синтетической последовательности. Разработан высокохемо- и стереоселективный метод окислительной димеризации мономерных хиральных пиридиновых N-оксидов, позволяющий синтезировать атропоизомерные бис-N-оксиды в граммовых количествах. Показана возможность использования O2 в качестве терминального окислителя и зависит от захвата кинетически образованных литийорганических агрегатов. Реакция может быть проведена в электрохимической ячейке. Альтернативный путь нуклеофильного присоединения является менее стереоселективным, но позволяет синтезировать несимметричные биарилы. Получены первоначальные данные о применении бипиридиновых N, N'-диоксидов и бипиридинов в асимметрическом катализе на примере кротилирования алифатического альдегида. На основании результатов исследований первого года выполнения проекта показано, что эффективность синтезированного химическим путем аналога природных антибиотиков дитерпеноидной природы возрастает при переходе клеток M. smegmatis в стационарную фазу периодической культуры, характеризующуюся формированием персистенции к клиническим антибиотикам. С высокой степенью достоверности предсказана мишень воздействия исследуемого вещества в виде белка RelMsm, уровень экспрессии которого возрастает в этот период. Подтверждение роли RelMsm как мишени исследуемого вещества получено в экспериментах по гиперэкспрессии гена relMsm, кодирующего данный белок. Исследование воздействия вещества на биопленкообразование, скольжение и поверхностные свойства M. smegmatis косвенно подтвердили предположение о RelMsm как мишени. При этом воздействие на микобактерии имитировало фенотип, описанный для мутантов M. smegmatis, лишенных способности образовывать данный белок. На основании изучения чувствительности клеток M. smegmatis к исследуемому веществу сделан вывод об усилении его антибактериальной активности в ответ на добавку полиаминов, соединений биогенной природы, которыми богаты ткани человека и животных, в отличие от клинических антибиотиков, эффективность которых снижается в присутствии этих соединений. Присутствие полиаминов в питательной среде отдаленно имитирует условия макрооганизма, в особенности в очаге воспаления и подчеркивает положительное свойство исследуемого вещества, открывая перспективу создания на его базе более эффективных антибиотиков, направленных на лечение инфекций, вызванных микобактериями.
Публикации
1. Сидоров Р.Ю., Кашеварова Н. М., Ткаченко А. Г. Вовлеченность белка Rel, метаболизирующего гуанозинтетрафосфат, в механизм действия антибиотиков, нацеленных на персисторные клетки Mycobacterium smegmatis Высокие технологии, определяющие качество жизни: Материалы II Международной науч. конф. (Пермь, 17–19 сентября 2018 г.) / Перм. гос. нац. исслед. ун-т. – Пермь, 2018., - (год публикации - 2018)
2. Vaganov V.Y., Yasuaki F., Shipilovskikh S.A., Rubtsov A.E., Malkov A.V. Asymmetric propargylation of aldehydes catalyzed by new chiral Lewis bases BOOK OF ABSTRACTS 2nd Conference "Modern synthetic methodologies for creating drugs and functional materials" (MOSM2018), PR5 (год публикации - 2018)
3. Vaganov V.Yu, Shipilovskikh S.A, Denisova E.I. Fukazawa Y, Malkov A.V., RubtsovA.E. New Axially Chiral bipyridines and their application in asymmetric catalysis for total synthesis BOOK OF ABSTRACTS 2nd Conference "Modern synthetic methodologies for creating drugs and functional materials" (MOSM2018), PR8 (год публикации - 2018)
Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Апробированы возможности альтернативных методов получения DMNP и серулатановых дитерпенов. Получен ряд перспективных прекурсоров для сборки серулатановых терпенов. С помощью описанного компьютерного прогноза был синтезирован ряд атропоизомерных N,N'-диоксидов, которые были протестированы в качестве базовых катализаторов Льюиса для асимметричного пропаргилирования альдегидов трихлоралденилсиланом. Арилзамещенные производные оказались очень активными и показали высокий уровень энантиоконтроля, из которых один катализатор был идентифицирован как наиболее эффективный, сохраняющий высокую реакционную способность даже при загрузке 1 мол.%. Широта реакции включает широкий спектр ароматических, гетероароматических и ненасыщенных альдегидов, в то время как алифатические альдегиды оказались сложными субстратами. Мы разработали удобный электрохимический метод восстановления связи N – O в ароматических N-оксидах. Способ допускает присутствие в ароматическом кольце таких сложных функциональных групп, как нитро и галогениды. В случае бипиридиновых производных оба окисленных азота одновременно дезоксигенируются. В сочетании с эффективным синтезом N-оксидов бипиридина, о котором мы сообщали в прошлом отчете, этот метод может обеспечить легкий доступ к аксиально-хиральным бипиридинам. Экспериментально показано усиление антибактериального эффекта стрептомицина и рифампицина при их комплексном использовании с DMNP, что в перспективе разработки антибактериального препарата на базе DMNP может найти применение в терапии микобактериальных инфекций. Исследование механизма действия DMNP показало, что мишенями его воздействия являются ферменты алармонсинтетазы, ответственных за синтез гуанозинтетрафосфата ((p)ppGpp), ключевого регулятора формирования персисторных клеток, толерантных к стрессам и антибиотикам. Роль RelMsm как мишени DMNP окончательно подтверждена экспериментально. Результаты исследований показали, что DMNP концентрационно-зависимо ингибирует (p)ppGpp-синтезирующую активность RelMsm, что снижает способность микобактерий формировать персисторы в ответ на стрессы и антибиотики и в конечном итоге является причиной гибели всей популяции микобактерий. Биогенные полиамины могут оказать влияние на эффективность действия антибиотиков на клетки микобактерий.
Публикации
1. Ахова А.В., Ткаченко А.Г. Multifaceted role of polyamines in bacterial adaptation to antibiotic-mediated oxidative stress Korean Journal of Microbiology, (2020) Vol. 56, No. 2 (год публикации - 2020) https://doi.org/10.7845/kjm.2020.0013
2. Нестерова Л.Ю., Цыганов И.В., Ткаченко А.Г. Влияние биогенных полиаминов на антибиотикочувствительность и поверхностные свойства клеток Mycobacterium smegmatis Applied Biochemistry and Microbiology, 2020, том 56, № 4, с. 342–351 (год публикации - 2020)
3. Фуказава Я., Рубцов А.Е., Малков А.В. A Mild Method for Electrochemical Reduction of Heterocyclic N-Oxides European Journal of Organic Chemistry, - (год публикации - 2020) https://doi.org/10.1002/ejoc.202000377
4. Фуказава, Я., Ваганов, В.Ю., Шипиловских, С.А., Рубцов, А.Е., Малков, А.В. Stereoselective Synthesis of Atropisomeric Bipyridine N,N′-Dioxides by Oxidative Coupling Organic Letters, № 12, V. 21, pp. 4798-4802 (год публикации - 2019) https://doi.org/10.1021/acs.orglett.9b01687
5. Ваганов В.В., Рубцов А.Е., Малков А.В. HIGHLY EFFICIENT ENANTIOSELECTIVE PROPARGYLATION OF ALDEHYDES CATALYZED BY AXIALLY CHIRAL BIPY-DIOXIDES BOOK OF ABSTRACTS International Conference CATALYSIS AND ORGANIC SYNTHESIS(ICCOS-2019), стр. 246 (год публикации - 2019)
6. Ваганов В.Ю,, Фуказава Я., Шипиловских С.А., Рубцов А.Е., Малков А.В. PREPARATION A SERIES OF ATROPISOMERIC BIPY-DIOXIDES BY OXIDATIVE COUPLING AND THEIR APPLICATION IN ASYMMETRIC CATALYSIS «Modern Synthetic Methodologies for Creating Drugs and Functional Materials» (MOSM2019) BOOK OF ABSTRACTS, OR-14 (год публикации - 2019)
7. Рубцов А.Е. NEW AXIALLY CHIRAL BIPYRIDINES AND THEIR APPLICATION IN ASYMMETRIC CATALYSIS «Modern Synthetic Methodologies for Creating Drugs and Functional Materials» (MOSM2019) BOOK OF ABSTRACTS, PL-5 (год публикации - 2019)
8. Рубцов А.Е., Ваганов В.В., Шипиловских С.А., Малков А.В. ASYMMETRIC PROPARGYLATION OF ALDEHYDES CATALYZED BY NEW CHIRAL LEWIS BASES BOOK OF ABSTRACTS Markovnikov Congress on Organic Chemistry, - (год публикации - 2019)
Аннотация результатов, полученных в 2020 году
На основании сравнения уровня персистообразования в контрольном родительском штамме M. smegmatis mc2155 и штаммах, несущих единичный (relMsm) и двойной (relMsmrelZ ) нокауты, в модели перехода в стационарную фазу изучен характер зависимости между частотой персисторных клеток и числом нокаутов при различных концентрациях DMNP. Установленна зависимость между уровнем алармонсинтетазной активности и активностью DMNP. Получены данные о комплементарности функций RelMsm и RelZ алармонсинтетаз в механизме действия DMNP посредством сравнения уровня персистообразования при реципрокной сверхэкпрессии плазмид с вставками кодирущих их генов в единичном (relMsm) и двойном (relMsmrelZ ) нокаутных штаммах в условиях воздействия DMNP. На основании морфологических и гравиметрических изменений характера биопленкообразования, а также данных о жизнеспособности планктонных клеток, сформировано представление о роли алармонситетаз в биопленкообазовании и их функции как мишеней DMNP.
Таким образом было показано, что синтетический аналог морского дитерпена эрогиоргиена, 4- (4,7-диметил-1,2,3,4-тетрагидро-нафталин-1-ил) пентановая кислота (DMNP), является лучшим из изученных нами и в целом в мире соединением лидером, направленным на предотваращение образования клеток-персистеров микобактерий. Чтобы идентифицировать мишень DMNP, в качестве модельного организма использовалась быстрорастущая Mycobacterium smegmatis, которая имеет фенотипическое и генетическое сходство с Mtb. Гиперфосфорилированный аналог гуанозина (p) ppGpp, продукт алармон-синтетаз RelMsm и RelZ, как известно, является одним из наиболее важных регуляторов устойчивости бактерий. Клетки, обработанные DMNP, проявляли фенотип, сходный с фенотипом, вызванным потерей функций алармон-синтетазами, включая персистентность и образование биопленок. Эксперименты in vitro продемонстрировали, что (p) активность очищенного рекомбинантного белка RelMsm по синтезу ppGpp ингибируется DMNP зависимым от концентрации образом. Наконец, моделирование молекулярного докинга предполагает, что DMNP может связываться с белками RelMsm и RelZ в непосредственной близости от их очень похожих сайтов связывания GTP, тем самым ингибируя их (p) ppGpp-синтезирующую активность. Также были апробированы возможности альтернативных методов получения серулатановых дитерпенов и отработан ряд ключевых стадий к синтезу, родственного противотуберкулезного соединения псевдоптеразина. Оптимизированны методологии асимметрического синтеза хиральных строительных блоков на основе реакции аллилтрихлорсиланов с катализаторами. Проанализированы и обобщены последние достижения в синтезе бипиридинов, также наши работы по асимметрическому кротилированию.
Публикации
1. Ваганов В.Ю., Фуказава Я., Кондратьев Н.С., Шипиловских С.А., Вилер С.Е., Рубцов А.Е. Малков А.В. Optimization of Catalyst Structure for Asymmetric Propargylation of Aldehydes with Allenyltrichlorosilane Advanced Synthesis and Catalysis, Volume 362, Issue23, Pages 5467-5474 (год публикации - 2020) https://doi.org/10.1002/adsc.202000936
2. Денисова Е.И., Шипиловских С.А., Рубцов А.Е. Asymmetric crotylation of aldehydes catalyzed by derivatives of amino acids AIP Conference Proceedings, Volume 2280, 4 November 2020, (год публикации - 2020) https://doi.org/10.1063/5.0018513
3. Ткаченко А.Г., Кашеварова Н.М., Сидоров Р.Ю., Нестерова Л.Ю., Ахова А.В., Цыганов И.В., Ваганов В.Ю., Шипиловских С.А., Рубцов А.Е., Малков А.В. A synthetic diterpene analogue inhibits mycobacterial persistence and biofilm formation by targeting (p)ppGpp synthetases Cell Chemical Biology, Volume 28, Issue 4 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.1016/j.chembiol.2021.01.018
4. Рубцов А.Е., Малков А.В. Recent Advances in the Synthesis of 2,2′-Bipyridines and Their Derivatives Synthesis (Germany, - (год публикации - 2021) https://doi.org/10.1055/s-0040-1706030
5. Рубцов А.Е., Малков А.В. Developing a Methodology for Catalytic Asymmetric Crotylation of Aldehydes SYNLETT, - (год публикации - 2021) https://doi.org/10.1055/s-0040-1706659
Возможность практического использования результатов
Результаты проекта имеют большое практическое значение. В результате выполнения проекта охарактеризовано вещество, способное подавлять персистентные формы микобактерий, препятствовать переходу микобактерий в дормантное состояние и установлен механизм его действия. Таким образом, возможно его использование при лечении туберкулеза, вызванного штаммами с множественной лекарственной устойчивость. С учетом высокой социальной значимости данного заболевания в мире и особенно в России, выпуск лекарств для лечения туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью не только внесет свой вклад в развитие фармацевтической отрасли РФ и, соответственно, в экономический рост, но и будет решать важную социальную проблему. Помимо этого, разработана технология скрининга новых потенциальных кандидатов, с возможностью закрепить отчищенную алармонсинтетазу на твердой подложке для использования в системах высокопроизводительного скрининга. Так же были разработаны методологии органического синтеза, которые в ряде случаев могут найти свое применение в промышленном синтезе энантиообогащенных субстанций, благодаря использованию дешевых трихлорислановых реагентов.