КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 18-74-00056

НазваниеКомплексное исследование водяного ореха Trapa L. с целью возрождения его аквакультуры

РуководительМихайлова Елена Владимировна, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное научное учреждение Уфимский федеральный исследовательский центр Российской академии наук, Республика Башкортостан

Период выполнения при поддержке РНФ 07.2018 - 06.2020 

Конкурс№29 - Конкурс 2018 года по мероприятию «Проведение инициативных исследований молодыми учеными» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными.

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-201 - Структурная, функциональная и эволюционная геномика

Ключевые словаTrapa natans, водяной орех, чилим, рогульник плавающий, Lythraceae, water chestnut, water caltrop, дербенниковые, RAPD, ISSR, секвенирование, бородатые корни, биологическая систематика, интродукция, аквакультура

Код ГРНТИ34.31.37


СтатусУспешно завершен


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
Водяной орех Trapa L. – однолетнее водное растение семейства Дербенниковые (Lythraceae), которое представляет интерес в качестве объекта фундаментальных исследований, а также является ценным пищевым и лекарственным растением. Он широко распространен на юге Евразии, в Африке, Северной Америке и Австралии. Это растение используется человеком со времен неолита как для употребления в пищу, так и на корм скоту, и может использоваться для фиторемедиации. Уникальными свойствами водяного ореха, которые могут найти практическое применение, являются способность его корней к фотосинтезу, а также высокая антибактериальная активность внутренней оболочки его плодов. В России водяной орех имеет дизьюнктивный ареал и находится под охраной во многих регионах. Чаще всего он обнаруживается в центральной европейской части, на юге Западной Сибири, в Забайкалье и на Дальнем Востоке. Нет единогласия относительно видового разнообразия Trapa L. в целом в России и в конкретных водоемах, например, в озере Упканкуль (Нуримановский район Республики Башкортостан) произрастает, по одним данным, два вида водяного ореха – водяной орех уральский (Trapa uralensis V.Vassil.) и водяной орех алатырский (Trapa alatyrica Spryg.), а по другим — один вид, водяной орех сибирский (T.rapa sibirica Fler.). При определении видов водяного ореха опираются, в основном, только на форму плодов, причем этот параметр может изменяться в зависимости от условий произрастания. В мире ситуация с изучением видового разнообразия этого растения обстоят не лучше. Например, в Китае ранее признавалось наличие 11 видов водяного ореха, однако в последние годы количество выделяемых видов сократилось до двух. В связи с этим, актуально проводить генетические исследования водяного ореха для уточнения вопроса видового разнообразия. Наиболее уникальные и интересные результаты по этому вопросу можно получить именно в России, где произрастает самое большое количество уникальных изолированных популяций и разновидностей водяного ореха в мире. В рамках данного проекта планируется исследование растений из нескольких регионов России и сотрудничество с китайскими, индийскими и белорусскими исследователями, заинтересованными в изучении и развитии аквакультуры водяного ореха. Планируемое исследование водяного ореха будет самым масштабным из проведенных на данный момент не только в России, но и в мире. Помимо генетического полиморфизма водяного ореха, будут исследованы условия его обитания. На данный момент не известно, почему в северной части ареала водяной орех сохранился только в определенных водоемах, имеются ли в этих водоемах специфические условия, был ли этот вид интродуцирован туда человеком, или сохранился после четвертичных оледенений. Также не полностью ясно, от чего зависит успешность интродукции, почему в одних регионах водяной орех является инвазивным, а в других - исчезающим видом. Получение данных об условиях среды обитания водяного ореха и его генетическом полиморфизме позволит прояснить эти вопросы. Для оценки возможности выращивания водяного ореха в аквакультуре в условиях российского климата, плоды водяного ореха из разных местообитаний будут собраны и пророщены как в аквариумах, так и в стерильных условиях in vitro для оценки влияния конкретных условий (температуры и содержания различных веществ в среде) на их жизнедеятельность. На стерильных эксплантах водяного ореха будут проведены эксперименты по получению бородатых корней, которые потенциально могут быть использованы для создания культур зеленых корней, способных расти на бедных питательных средах. Собранные в озере Упканкуль плоды будут интродуцированы в водоемы Республики Башкортостан, поскольку являются крайне актуальными работы по восстановлению численности этого редкого растения. Разносторонний анализ растений и их местообитаний на всей территории России, запланированный в рамках данного проекта, позволит уточнить актуальные практические и фундаментальные вопросы, оценить генетическое разнообразие популяций из различных регионов России и мира, а также возможности для интродукции водяного ореха в подходящие для этого водоемы и его культивирования в аквакультуре. Впервые в мире будут проведены работы по изучению генетического полиморфизма, видового разнообразия и эволюции различных российских популяций водяного ореха при помощи современных генетических методов. Все полученные в ходе научных исследований данные будут использованы для возрождения аквакультуры водяного ореха в России.

Ожидаемые результаты
1) Впервые будут получены многочисленные данные о генетическом полиморфизме водяного ореха из различных местообитаний. Они помогут в решении фундаментальных вопросов происхождения и видового разнообразия водяного ореха, на которые до сих пор нет однозначного ответа. Также эти данные необходимы для эффективной реализации практических мер по охране этого реликтового растения. 2) Будет произведен поиск оптимальных условий произрастания водяного ореха на северной границе его ареала, поиск его форм, более приспособленных к суровым климатическим условиям, и эксперименты по его интродукции в подходящие водоемы. Это важно как для сохранения водяного ореха в России, так и для возвращения его в широкое употребление человеком. Водяной орех будет интродуцирован в ряд подходящих для этого озер. Также будет проведена оценка возможности введения его в аквакультуру в России. 3) Будет проведен поиск действующих веществ, содержащихся во внутренней оболочке плодов водяного ореха и обладающих высокой антибактериальной активностью. Эти вещества могут найти применение в медицине. 4) Исследование поможет привлечь внимание научного сообщества и общественности к проблеме сохранения редких видов растений, в том числе водяного ореха. Значение этого растения недооценено, поэтому режим его охраны часто не соблюдается. За ХХ век водяной орех вымер на большей части своего ареала в России. В некоторых водоемах водяной орех продолжает вымирать даже в наше время, в том числе и из-за антропогенного фактора. Результаты нашего исследования помогут обосновать необходимость более тщательной и строгой охраны этого редкого растения, а также восстановления его численности путем интродукции и реинтродукции в подходящие для этого водоемы.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Одними из наиболее слабо изученных являются популяции водяного ореха на Южном Урале, в связи с чем были предприняты экспедиции на четыре озера Упканкуль, Бильгиляр, Лебяжье и Медвежье с целью отбора листьев для выделения ДНК и генетического анализа, а также исследования условий обитания водяного ореха. К огромному сожалению, мы не смогли обнаружить водяной орех в озере Белужье, где он обитал ранее, согласно данным Красной книги Оренбургской области. Возможно, в этом озере он вымер, либо его численность критически сократилась. Для сохранения местообитаний водяного ореха необходимо поддержание гидрологического режима озер-стариц, где он преимущественно встречается, поскольку они имеют тенденцию к заболачиванию. Высокая минерализация, неблагоприятные щелочность и жесткость воды, недостаток осадков служат угрозой существованию местообитаний водяного ореха в Оренбургской области. Для самих растений опасность представляют вредители. В 2018 году численность плавающих розеток водяного ореха в озере Упканкуль уменьшилась на две тысячи по сравнению в 2017 годом, а атака вредителя козявки кувшинковой может способствовать еще большему снижению численности водяного ореха в Республике Башкортостан в 2019 году. С целью сохранения популяции семена водяного ореха, собранного в озере Упканкуль, были интродуцированы в девять различных водоемов, а также использованы для получения аквариумной культуры и культуры in vitro. Последнюю удается получить только из эмбрионов на питательных гормональных средах. Удается преодолеть контаминацию эмбрионов бактериями, связанную с о сложностью стерилизации семян, и потемнение проростков и питательных сред, связанное с накоплением фенольных соединений. Трансформация эксплантов и цельных растений in vitro при помощи Agrobacterium rhizogenes штаммов А4 и 15834 оказалась безуспешной, вероятно, потому, что водяной орех не подвержен заражению агробактериями, либо вероятность этого события крайне мала. Фотосинтезирующие «бородатые» корни водяного ореха могут быть использованы как экономные биофабрики по производству ценных метаболитов. Будет предприняты попытка добиться их получения с использованием биобаллистической пушки. Огромное значение для возрождения аквакультуры водяного ореха является доказательство наличия антибактериальных и других полезных свойств у его кожуры, а также идентификация действующего вещества или группы веществ. Все полученные нами экстракты были эффективны против кишечной палочки и золотистого стафилококка. Для сохранения водяного ореха — редкого реликтового растения — важно иметь представление о его генетическом разнообразии. До сих пор точно не известно, сколько видов стоит выделять в семействе Trapa. Мы проанализировали ДНК водного ореха из 12 местообитаний методами RAPD- и ISSR- с применением 23 различных праймеров и обнаружили, что растения из Приморского края и Амурской области, определенные как T. maximowiczii, стабильно демонстрируют генетические отличия, тогда как уровень полиморфизма у всех остальных образцов низок. В связи с этим, было проведено пробное секвенирование ядерной последовательности ITS и хлоропластных последовательностей trnH-psbA, atpF-atpH и rpoC1 девяти образцов ДНК водяного ореха, что позволит оценить пригодность этих молекулярных маркеров для видоидентификации и филогенетики водяного ореха. Ранее, проанализировав доступные сиквенсы, мы обнаружили, что ген матуразы К для этого не подходит, поскольку оказался у водяного ореха слишком консервативным. Также мы собрали значительное количество гербарных образцов как российских, так и зарубежных популяций, среди которых недостает только Алтайской, которая на данный момент мало исследована и представляет большой научный интерес ввиду своей изолированности и риска скорого вымирания из-за варварского поведения отдыхающих. Продолжение исследований генетической гетерогенности популяций водяного ореха в России, его видового разнообразия позволят более эффективно обеспечивать его охрану.

 

Публикации

1. Артюхин А.Е., Михайлова Е.В., Кулуев Б.Р. Исследование изолированных популяций водяного ореха Trapa sibirica Fler. (Lythraceae) в Республике Башкортостан Вестник Пермского университета. Серия Биология, Номер: 3 Год: 2019 Страницы: 217-226 (год публикации - 2019) https://doi.org/10.17072/1994-9952-2019-3-217-226

2. Михайлова Е.В., Артюхин А. Е., Мусин Х. Г., Пшенникова Л. М., Кожевникова З. В., Кулуев Б. Р. Biology of water caltrop Trapa L. (Lythraceae) in The Southern Urals Aquatic botany, - (год публикации - 2019)

3. Михайлова Е.В., Артюхин А.Е., Кулуев Б.Р. Ecology Of Water Caltrop Trapa L. In The Southern Urals 3rd International Conference „Smart Bio“ 02-04 May 2019 KAUNAS LITHUANIA ABSTRACT BOOK, стр. 40 (год публикации - 2019)

4. Михайлова Е.В., Артюхин А.Е., Шевченко А.М., Горте Э., Кулуев Б.Р. Экологические аспекты охраны и культивирования водяного ореха Trapa L. Материалы всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Современные подходы и методы в защите растений», c. 179-181 (год публикации - 2018)


Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Проект «Комплексное исследование водяного ореха Trapa L. с целью возрождения его аквакультуры» посвящен редкому реликтовому растению водяному ореху. Он широко распространен в Азии, Африке, Северной Америке и Австралии. Однако и в более северных регионах есть места, где он до сих пор сохранился. В России водяной орех признан редким видом и находится под охраной, встречается на юге Европейской части, в районе Южного Урала, Алтая и на Дальнем востоке. В азиатских странах водяной орех является важной частью рациона человека, и популярность его только растет. Растущий интерес к этому растению обусловлен еще и наличием в его кожуре антимикробных соединений, которые не позволяют плоду испортиться во время зимовки в иле, на дне водоема. Водяной орех культивируется со времен неолита, как для употребления в пищу человеком, так и на корм скоту, однако в России в связи с сокращением численности популяции о возможности использовать водяной орех в пищу забыли. Но это не значит, что восстановление культуры его употребления невозможно. В рамках работы по гранту были предприняты экспедиции на три озера на Алтае, являющиеся местообитаниями водяного ореха, согласно Красной книге — Манжерокское, Ая и Канонерское. Алтайские популяции, как и Южноуральские, которые были исследованы ранее в рамках этого проекта, являются одними из наиболее изолированных и неисследованных популяций водяного ореха в мире. По некоторым данным, произрастающие здесь растения — эндемичные виды, Trapa sibirica и Trapa pectinata. Оказалось, что в озере Ая водяной орех был уничтожен человеком, в озере Манжерокском популяция под угрозой исчезновения — остались последние 20 розеток. Виной этому — варварская очистка озер для привлечения туристов. В озере Канонерском, несмотря на сообщения о том, что водяной орех здесь уже вымер, а озеро почти высохло, мы обнаружили довольно большую популяцию (около тысячи розеток). По всей видимости, экосистема озера, ныне заброшенного и не посещаемого туристами, восстанавливается. Было исследовано наиболее известное местообитание водяного ореха в Европе — озеро Скадарское (Черногория). В этом озере были впервые обнаружены растения с двурогими плодами (обычно считается, что такие растения встречаются только в Азии и часто выделяются даже в отдельный вид — T. bispinosa). Также оказалось, что плоды из этого озера на 80% тяжелее, из озер на северной границе ареала, тогда как размеры розеток в некоторых озерах Южного Урала были даже крупнее. Была проведена успешная интродукция водяного ореха в 5 озер, отличавшиеся меньшей глубиной и более высокой температурой воды, чем озера, в которых не наблюдалось всходов. Наиболее впечатляющего результата удалось достичь в озере Долгое — из 100 посаженных семян выросло более 900 плавающих розеток. Был подготовлен видеоролик с кадрами из экспедиций https://www.youtube.com/watch?v=dLdL30wVlIc&t Была проанализирована совокупность данных по морфометрии, составу воды и донных отложений. Водяной орех продемонстрировал толерантность и к глубине водоема (40-250 см), и к рН (6,8-8,75), и к минерализации, и к содержанию кальция. Но наиболее крупными розетки были при наименьшей глубине озера (40-50 см). Водоемы, где произрастает водяной орех, имели превышение установленных нормативов по содержанию железа и марганца, а в донных отложениях имелось сульфатное засоление. При этом в озерах наблюдалось низкое содержание хлоридов. Эксперимент по проращиванию семян водяного ореха в аквариуме подтвердил, что соляная кислота либо её соли приводят к практически полной потере всхожести. Также всхожесть падала на 40-50% при снижении температуры всего на 3°C (с 25 до 22°C). Показано негативное влияние низких положительных температур (+5°С, при которой происходила стратификация) на проростки. Были получены «бородатые корни» (hairy roots) водяного ореха при помощи A. rhizogenes в аквариумной и in virto культуре, а также при помощи биобаллистики. Микроскопия показала наличие хлоропластов в hairy roots, а также отличия от обычных корней по форме клеток. В составе кожуры водяного ореха был идентифицирован ряд соединений, относящихся, преимущественно, к флавоноидам. Интересно, что в нашем случае в кожуре не был обнаружен антифунгальный пептид Tn-AFP1, который был идентифицирован при исследовании водяного ореха в Индии. Была исследована ДНК водяного ореха из 15 местообитаний, относящихся к 8 предполагаемым видам (T. natans, T. sibirica, T. pectinata T. pseudincisa, T. manshurica, T. maximowiczii, T. japonica, T. korshinskyi). Методами RAPD и ISSR, а также секвенирования хлоропластных маркеров trnL-F, rpoC1, atpF-atpH, rpS4-trnT и ядерных маркеров ITS и AP2 показано, что T. sibirica, T. pectinata, T. pseudincisa, T. manshurica, T. japonica и T. korshinskyi генетически достоверно не отличаются от вида T. natans. Тогда как вид T. maximowiczii может быть идентифицирован с использованием любого из использованных методов. Экспериментальные работы по гранту выполнены в полном обьеме. Результаты нашего генетического исследования позволяют предположить, что исследованные популяции водяного ореха не сохранялись здесь с третичного периода (когда появился водяной орех как таковой), а были занесены человеком из Азии около 8000 лет назад, во время Атлантического палеоклиматического периода, вместе с другими сельскохозяйственными культурами.

 

Публикации

1. Elena V. Mikhaylova, Alexander Artyukhin, Khalit Musin, Gulnar Gumerova, Bulat Kuluev The first report on the induction of hairy roots in Trapa natans, a unique aquatic plant with photosynthesizing roots Plant Biotechnology Reports, - (год публикации - 2020)

2. Артюхин А.Е., Михайлова Е.В., Кулуев Б.Р. Genetic variation of water caltrop (Trapa L.) in several Russian populations Current Challenges in Plant Genetics, Genomics, Bioinformatics, and Biotechnology., Artyukhin A.E., Mikhaylova E.V., Kuluev B.R. Genetic variation of water caltrop (Trapa L.) in several Russian populations. Current Challenges in Plant Genetics, Genomics, Bioinformatics, and Biotechnology. 2019;44-45. DOI: 10.18699/ICG-PlantGen2019-12 (год публикации - 2019) https://doi.org/10.18699/ICG-PlantGen2019-12

3. Е.В. Михайлова, А.Е. Артюхин, М.А. Панфилова, Б.Р. Кулуев Особенности произрастания водяного ореха Trapa natans L. на северной границе ареала Биология внутренних вод, - (год публикации - 2020)

4. Михайлова Е.В., Артюхин А. Е., Пшенникова Л. М., Кожевникова З. В., Кулуев Б. Р. Ecological genetic study of water caltrop from four regions of Russia and Skadar Lake in Montenegro Hydrobiologia, - (год публикации - 2020)

5. Артюхин А.Е., Михайлова Е.В., Кулуев Б.Р. Genetic resources of water caltrop Trapa L. Plant Genetics, Genomics, Bioinformatics, and Biotechnology (PlantGen2019) Abstracts. Eds. A.V. Kochetov, E.A. Salina. Institute of Cytology and Genetics, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences; Novosibirsk: ICG SB RAS, 2019. 255 pp, Genetic resources of water caltrop Trapa L. Artyukhin A.E., Mikhaylova E.V., Kuluev B.R. Plant Genetics, Genomics, Bioinformatics, and Biotechnology (PlantGen2019) Abstracts P. 31 (год публикации - 2019) https://doi.org/10.18699/PlantGen2019-013

6. Михайлова Е.В., Артюхин А.Е., Зулькарнаева Е.Ш., Кулуев Б.Р. Водяной орех - растение будущего IX Съезд общества физиологов растений России «Физиология растений – основа создания растений будущего» (Казань, 18–24 сентября 2019 г.): тезисы докладов. – Казань: Издательство Казанского университета, 2019. – 533 с., с. 292 (год публикации - 2019) https://doi.org/10.26907/978-5-00130-204-9-2019-292

7. Михайлова Е.В., Артюхин А.Е., Кулуев Б.Р. GENETIC DIVERSITY OF TRAPA L. POPULATIONS IN RUSSIA AND EUROPE Сборник тезисов Международного Конгресса «VII Съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров, посвященный 100-летию кафедры генетики СПбГУ, и ассоциированные симпозиумы» (18-22 июня 2019 г., Санкт-Петербург, Россия),, - (год публикации - 2019)

8. Михайлова Е.В., Артюхин А.Е., Мусин Х.Г., Кулуев Б.Р. Biology of water chestnut Trapa L FEBS Open Bio, V 9 (Suppl.1) (2019) P 279-280 (год публикации - 2019) https://doi.org/10.1002/2211-5463.12675

9. - Водяной орех Видеоблог о работе ученых в реальном времени "Под стеклом", Видеосюжет о проделанной работе (год публикации - )

10. - В Уфе прошел Бал молодых ученых Bash.News., Репортаж с мероприятия «III Бал-выставка научных достижений молодых учёных», где я рассказываю о своем проекте с указанием на поддержку РНФ (год публикации - )


Возможность практического использования результатов
Разработанные методы in vitro и аквариумного культивирования водяного ореха, его агробактериальной и биобаллистической трансформации открывают новые возможности по улучшению потребительских свойств водяного ореха методами генной инженерии и геномного редактирования. Фотосинтезирующие hairy roots водяного ореха могут быть испоьзованы как биофабрики по производству ценных биологически активных соединений. Полученные нами данные о низком генетическом разнообразии популяций водяного ореха с территории России и Европы, а также успешный опыт интродукции в новые местообитания дают основания полагать, что можно успешно восстановить этот редкий вид там, где он вымер или находится под угрозой вымирания. Полученные нами данные об оптимальных условиях произрастания водяного ореха могут быть полезны для его коммерческого культивирования в России.