Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Один из самых распространенных вирусных патогенов - респираторно-синцитиальный вирус (РСВ). К настоящему моменту не создано эффективных, безопасных и при этом доступных средств его лечения и профилактики. Попытки создать профилактическую вакцину оказались неудачными, поэтому в настоящее время для лечения РСВ-инфекции применяется только виразол (рибавирин), однако он вызывает многочисленные побочные эффекты. Создаются препараты на основе моноклональных антител, однако их использование будет дорогостоящим. Одним из привлекательных направлений в создании антимикробных и антивирусных препаратов является применение природных пептидов и их синтетических аналогов в качестве фармацевтических агентов. Природные пептиды являются неотъемлемой частью врожденного иммунного ответа с бактерицидными, иммуномодулирующие и противовирусными свойствами. Однако их применение в медицинской практике сопряжено с рядом проблем. В частности, процесс выделения пептидов из природных источников затратен, искусственный синтез крупных природных пептидов обходится ненамного дешевле, не высокая стабильность - линейные пептиды легко разрушаются протеазами. Несмотря на вышеуказанные сложности создаются способы их преодоления. В первую очередь это картирование крупных пептидов и выявление в их структуре биологически-значимой части. Во-вторых, это стабилизация структуры пептидов за счет введения точечных аминокислотных замен или дополнительных химических связей. В-третьих - дендримеризация (синтез разветвленных структур) пептидов, посредством чего можно добиться повышения их стабильности. Таким образом, главная цель данной работы - проектирование линейных и дендримерных катионных пептидов и изучение их противовирусной активности в отношении РСВ. В задачи исследования на 1-й год работы входило: 1. дизайн пептидов с линейной и с дендримерной структурами, 2. изучение цитотоксичности пептидов в экспериментах in vitro, 3. первичный скрининг анти-РСВ активности пептидов в экспериментах in vitro. Из данных литературы известно, что противовирусной активностью как правило обладают пептиды, состоящие из позитивно заряженных аминокислот, обладающие способностью взаимодействовать с биологическими мембранами за счет наличия амфифильной структуры и имеющие α-спиральную структуру. Учитывая это было синтезировано 22 пептида из них 6 дендримерных разветвленных пептида. Синтез пептидов осуществлялся твердофазным методом. Очистка пептидов осуществлялась в две ступени: 1) методом гель-фильтрации и 2) методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Подтверждение структуры пептидов осуществляли методом масс-спектрометрии. В качестве контроля в исследованиях использовали природный пептид кателицидин - LL-37. Первоначально изучили цитотоксичность пептидов в МТТ-тесте на культуре клеток МА-104 (эмбриональная почка обезьяны). Контрольный пептид LL-37 ожидаемо обладал выраженным цитотоксическими свойствами. У 6-ти из 22-х пептидов коллекции выявлены цитотоксические свойства. Повышенной цитотоксичностью обладали пептиды, имеющие спиралевидную структуру, пептиды с т.н. «жирным хвостом» и пептиды с большой плотностью положительного заряда. По всей видимости данные пептиды оказывают повреждающее действие на мембрану клетки, приводя к потере её жизнеспособности. Для остальных 16-ти пептидов явных цитотоксических эффектов не обнаружено. Противовирусную активность оценивали in vitro на культуре клеток МА-104. Для этого пептиды в нетоксических концентрациях смешивали с РСВ штамм А2 и инкубировали в течение 2 ч после чего осуществляли титрование на монослое клеток МА-104. В качестве контроля вирус инкубировали с физиологическим раствором. После инкубации в течении 3 суток оценивали цитопатическое действие вируса на клетки методом световой микроскопии. Контрольный пептид LL-37 подавлял титр РСВ в 25 раз, что совпадает с ранее опубликованными данными. Из 22-х исследуемых пептидов 17 образцов статистически значимо подавляли титр вируса в среднем в 10 раз. При этом максимальной противовирусной активностью из линейных пептидов обладали катионный пептид NC-737, нейтральный спиралевидный пептид КО-1 и катионный пептид AS-35, которые снижали титр РСВ в 14, 25 и 33 раза, соответственно. Максимальной антивирусной активностью обладал дендримерный пептид LTP, снижавший титр РСВ в 100 раз. Такая высокая противовирусная активность LTP вероятно обусловлена значительным положительным зарядом пептида, который обеспечивается за счет наличия в его составе 8 остатков аргинина и 5 остатков лизина. Тем не менее, другой аргинин-богатый пептид, но с линейной структурой NC-810 (содержит 11 остатков аргинина) не обладает такими противовирусными свойствами. Скорее всего эти отличия могут быть обусловлены трехмерной структурой пептидов, первый из которых имеет разветвленную (дендримерную структуру), а последний – линейную спиралевидную. Дендримерная структура позволяет создавать кластер положительно заряженных аминокислот, что по всей видимости, является ключевым для взаимодействия с вирионом. В дополнительных экспериментах продемонстрировано дозозвисимое подавление титра РСВ пептидом LTP. Значения EC50 для LTP (концентрация, подавляющая титр вируса на 50%) составили 1,4±0,4 мкг/мл, что сопоставимо с активностью природного пептида LL-37 (ЕС50 = 0,7 – 5,6 мкг/мл). Цитотоксичность LTP в 200 раз ниже, чем у LL-37, что делает его перспективным для дальнейшего исследования.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Известно, что многие природные пептиды проявляют выраженную антимикробную и противовирусную активность. Однако природные пептиды имеют довольно сложную структуру, часто содержат дисульфидные связи и малодоступны для практического применения из-за низкой стабильности и высокой токсичности. Данный проект посвящен созданию синтетических пептидов с линейной и дендримерной структурами, обладающими противовирусным свойствами в отношении респираторно-синцитиального вируса (РСВ). На данном этапе была дополнительно синтезирована коллекция из 6-ти дендримерных и линейных пептидов, обладающих потенциальным специфическим сродством к возможным терапевтическим мишеням при лечении РСВ, в частности на поверхности вируса к белку F и рецепторным белкам (нуклеолин C23, малая ГТФаза RhoA) на поверхности клетки человека, участвующим в слиянии вируса с клеткой. Изучена цитотоксичность данных пептидов и показано, что дендримерные пептиды с большой плотностью положительного заряда KK-42, KK-45 и KK-46 проявляли выраженный цитотоксический эффект. По всей видимости, данные пептиды оказывают повреждающее действие на мембрану клетки, приводя к потере её жизнеспособности. Скрининг антивирусной активности показал, что все 6 пептидов статистически значимо снижали титр РСВ в 5 – 10 раз. В рамках предыдущего этапа работы №1 было синтезировано 17 вариантов пептидов с анти-РСВ активностью. На втором этапе дополнительно было синтезировано 6 вариантов пептидов, при этом все из них проявляли аналогичный анти-РСВ эффект. Таким образом, по итогам работ этапов 1 и 2 было синтезировано 23 пептида с анти-РСВ активностью. На втором этапе работы мы сконцентрировались на исследовании механизмов антивирусной активность некоторых наиболее перспективных вариантов пептидов. Было показано, что денримерные пептиды KK-45, bLTP и KK-46 значительно ингибируют связывание РСВ и клеток-мишеней, т.к. предварительная инкубация их с клетками значительно предотвращала инфекцию. Также вышеуказанные пептиды обладают высокими значениями индексов безопасности СС50/ЕС50 = 50, 12,2 и 8,8. В одной из работ [Lambert и др., 1996] была продемонстрирована антивирусная активность пептидов из HRB-домена F-белка. Домены HRA и HRB участвуют в структурных перестройках белка F, что необходимо для слияния вируса с клеткой и инициации инфекционного процесса. Проектированные Lambert и коллегами [Lambert и др., 1996] пептиды связывались с доменом HRB и тем самым препятствовали инфекции. Учитывая это мы спроектировали линейный пептид КК-44 из HRA-домена F-белка (AA201-212), а также его модифицированный вариант с дендримерным пептидом (R4K2K) на N-конце молекулы– пептид КК-45. Совместная инкубация КК-45 (но не линейного КК-44) с РСВ при +4С в значительной степени препятствовала последующему инфекционному процессу. По всей видимости данный пептид взаимодействовал с вирионами и препятствовал функционированию белка F вируса. В пользу этой гипотезы свидетельствует тот факт, что КК-45 связывается с РСВ, что подтверждается данными ИФА-анализа. Однако линейный пептид КК-44, не обладающий значительными анти-РСВ свойствами, более интенсивно связывается с РСВ. Это может свидетельствовать о том, что связывание линейного пептида с РСВ не приводит к нарушению функционирования белка F. В то же время наличие разветвленной структуры на N-конце пептида КК-45 стерически препятствует нормальной функции белка F, а именно нарушает его структурную перестройку из префузионой в фузионную форму. В отдельном исследовании была изучена прямая вирулицидная активность пептидов. Наибольшим эффектом обладал дендримерный пептид bLTP. Другой дендрмерный пептид КК-45 также оказывал прямое вирулицидное действие на вирионы, но в меньшей степени. Крупные дендримерные пептиды с высокой плотностью позитивного заряда (+16 для bLTP и +8 для КК-45) могут оказывать прямое дестабилизирующее действие на оболочку РСВ, что в итоге приводит к снижению жизнеспособности вируса. Однако другой крупный дендримерный пептид КК-46 (заряд +18) не обладал такой активностью, по всей видимости, он проявляет свой анти-РСВ эффект по другому механизму. Данный пептид моделирует РСВ-связывающий участок поверхностного белка клеток RhoA, который играет роль рецептора для РСВ [Pastey и др., 2000] [Ortega-Berlanga и др., 2016]. Предположительно основной механизм действия КК-46 – это ингибирование процесса связывания вириона с клеткой-мишенью, что объясняет его высокую анти-РСВ активность в другом тесте – ингибирование прикрепления вируса к клетке. В ряде публикаций сообщалось о способности некоторых природных пептидов (например, дефензинов [Watford и др., 2003] [LeMessurier и др., 2016], мелиттина [Uddin и др., 2016] и LL-37 [Lai и др., 2011] активировать компоненты врожденного иммунитета и тем самым проявлять свой антивирусный эффект. Учитывая это, для некоторых наиболее активных пептидов мы также изучили их способность активировать врожденный иммунитет, в частности гены, ответственные за противовирусную защиту: IFNa2, MX1, ISG56, OAS1 и STAT1 [Sadler, Williams, 2008]. Проведенные исследования показали, что синтетические пептиды: bLTP, D12, KK-44, KK-45 и KK-46 не оказывают стимулирующего действия на гены противовирусной защиты. Эти данные согласуются с современными работами, свидетельствующими о том, что механизм действия пептидов зачастую не зависит от активации системы интерферонов [Currie и др., 2016]. Один из путей распространения РСВ – трансмиссия от одной инфицированной клетки к другой – неинфицированной [Battles, McLellan, 2019]. Данный способ распространения отчасти реализуется за счет формирования синцитиев – группы слившихся клеток. Учитывая это, мы изучили способность пептидов блокировать межклеточное распространения путем подсчета площади синцития. Проведенное исследование показало, что самое максимальное снижение площади синцитиев обеспечивал дендримерный пептид bLTP. Таким образом, наиболее перспективными для дальнейшего исследования в экспериментах in vivo являются: 1. дендримерный пептид KK-45, блокирующий вход вируса в клетку как за счет связывания с клеточным рецептором нуклеолином, так и за счет связывания с лигандами (предположительно белком F) на поверхности РСВ. 2. дендримерный пептид KK-46, блокирующий вход вируса в клетку за счет связывания с клеточным рецептором – RhoA. 3. дендримерный пептид bLTP, проявляющий анти-РСВ эффект по различным механизмам: как за счет связывания с клеточным рецептором нуклеолином, так и дестабилизации вирионов и препятствия межклеточной трансмиссии вируса от клетки к клетке. Примечательно, что наибольшим антивирусным эффектом обладают дендримерные пептиды, а не линейные. Возможно, это объясняется их большей устойчивостью к ферментам, разрушающим пептидные связи (протеазам), находящихся в биологических средах, что было подтверждено нами экспериментально. Дендримерные пептиды, в виду высокой протеолитической стабильности, являются перспективными соединениями для создания новых антивирусных препаратов.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Известно, что многие природные пептиды проявляют выраженную антимикробную и противовирусную активность. Однако природные пептиды имеют довольно сложную структуру, часто содержат дисульфидные связи и малодоступны для практического применения из-за низкой стабильности и высокой токсичности. Данный проект посвящен созданию синтетических пептидов с линейной и дендримерной структурами, обладающими противовирусным свойствами в отношении респираторно-синцитиального вируса (RSV). На предыдущем этапе работы было показано, что из 26 протестированных варианта дендримерные пептиды KK-45, bLTP и KK-46 обладают максимально выраженными антивирусными свойствами и обладают высокими значениями индексов безопасности СС50/ЕС50 = 50, 12,2 и 8,8. Исследования механизмов антивирусного действия показано, что КК-45 взаимодействует с вирионами и препятствует функционированию белка F вируса. Дендримерный пептид КК-46 моделирует RSV-связывающий участок поверхностного белка клеток RhoA, который играет роль рецептора для RSV [Pastey и др., 2000] [Ortega-Berlanga и др., 2016]. Предположительно основной механизм действия КК-46 – это ингибирование процесса связывания вириона с клеткой-мишенью. Наиболее вероятный механизм действия bLTP – конкурентное ингибирование нуклеолина – рецептора для RSV. В рамках третьего этапа проведено исследование антивирусных эффектов трех дендримерных пептидов КК-45, bLTP и КК-46 в экспериментах in vivo на модели RSV-инфекции мышей. Синтезированные пептиды вводили животным в лечебно-профилактическом режиме (т.е. первое введение пептидов осуществлялось за несколько часов до инфекции, и продолжалось в течение нескольких дней после инфицирования мышей вирусом). Учитывая, что механизм действия пептидов связан либо блокированием входа вируса в клетку, либо с прямым вирулицидным действием, то изучение профилактического режима введения сочли не целесообразным, т.к. для реализации пептидами своих антивирусных свойств необходим прямой их контакт с патогеном. Также с учетом механизмов действия пептидов они вводились мышам интраназально, т.е. в очаг репликации вируса. Перед проведением исследований на модели RSV-инфекции были предварительно проведены токсикологические исследования in vivo с целью установить переносимые и летальные дозы пептидов. Максимальные переносимые дозы для пептидов bLTP, КК-46 и КК-45 составили 162,5 мг/кг. На основе данных о гибели животных рассчитаны летальные дозы: для bLTP рассчитанная LD50 = 325 мг/кг; для КК-46 LD84 = 325 мг/кг; для КК-45 LD67 = 325 мг/кг. Согласно этим данным, пептиды bLTP, КК-46 и КК-45 можно отнести к классу малотоксичных соединений по классификации токсичности К.К. Сидорова, и следовательно изучать их антивирусные свойства в широком диапазоне доз. Проведенные исследования на модели RSV-инфекции у мышей показали, что интраназальное применение дендримерных пептидов КК-45, bLTP и КК-46 существенно снижает вирусную нагрузку в легких, что подтверждается методами количественной ПЦР и титрования на монослое клеток. При этом максимальным антивирусным эффектом обладает дендримерный пептид КК-46, которым снижает вирусную нагрузку в легких в 17 раз, что согласуется с ранее проведенными исследованиями in vitro. Дендримерные пептиды КК-45, bLTP и КК-46, снижая вирусную нагрузку в легких, тем самым способствовали уменьшению воспаления респираторного тракта, что выражалось в снижении степени инфильтрации легких провоспалительными клетками (главным образом макрофагами и лимфоцитами). Стоит отметить, что несмотря на то, что максимальным антивирусным эффектом обладает пептид КК-46, максимальное уменьшение воспаления достигается при использовании bLTP. Это свидетельствует о том, что пептиду bLTP могут быть присущи не только антивирусные, но и антивоспалительные свойства. Учитывая, что оболочечные вирусы имеют сходство в строении вириона и в механизмах проникновения в клетку, то нами была изучены способность этих пептидов проявлять антивирусный эффект в отношении вируса гриппа в экспериментах in vitro на культуре клеток MDCK. Изучение противовирусной активности показало, что только пептид КК-45 специфически ингибировал размножение вируса гриппа А/Калифорния/04/09 (пндм H1N1). Значения ИК50 для KK-45 в составили 23,24±7,03 мкг/мл, при этом индекс селективности составил величину порядка 13,8. Таким образом, пептид КК-45 обладает более широким антивирусным спектром действия подавляя как репликацию RSV, так и вируса гриппа в то же время пептиды bLTP и KK-46 оказывают более узкий антивирусный эффект, подавляя репликацию RSV, но не вируса гриппа. Это объясняется тем, что пептид bLTP конкурентно воздействует на белок нуклеолин (C23), а пептид КК-46 на белок ГТФазу (RhoA), которые являются рецепторами для RSV. В то же время пептид КК-45 в большей степени воздействует на лиганды вириона, что обеспечивает более широкий спектр антивирусной активности в отношении структурно сходных патогенов (оболочечные вирусы). Дендримерный пептид КК-45 был дополнительно изучен на модели RSV-инфекции мышей в сравнении с двумя контрольными пептидами: КК-44 – линейна форма пептида КК-45, D12 – короткий дендримерный пептид. Проведенные исследования показали, что интраназальное применение дендримерного пептида КК-45 в наибольшей степени снижало вирусную нагрузку в легких, что подтверждено методами количественной ПЦР (2,6 раза) и титрования на монослое клеток (в 15 раз). При этом линейная форма этого пептида КК-44 не влияла на репликацию вируса, а короткий дендримерный пептид D12 лишь незначительно уменьшал количество RSV в респираторном тракте. Подавление вирусной нагрузки под действием пептида КК-45 приводило к заметному уменьшению RSV-индуцированного воспаления в легких, что выражалось в существенном снижении числа инфильтрирующих ткань легких клеток. Наблюдали 2-кратное снижение количества провоспалительных клеток в БАЛ (главным образом макрофагов и лимфоцитов) и в перибронхиальных инфильтратах, а также сокращалась площадь самих инфильтратов в ткани легких. О снижении воспаления также свидетельствовало более чем 2-кратное уменьшение экспрессии провоспалительных цитокинов IFNg и TNFa в клетках БАЛ. Несмотря на уменьшение вирусной нагрузки и степени воспаления легких у мышей получавших КК-45 не отмечено восстановления дыхательной функции легких и толщины стенок бронхов. Вероятно, для нормализации таких нарушений требуется более длительный восстановительный период. Таким образом, проведенные на модели RSV-инфекции у мышей исследования показали, что дендримерные пептиды КК-45, bLTP и КК-46 обладают антивирусными свойствами. Максимальный антивирусный эффект оказывал пептид КК-46, однако пептид bLTP дополнительно оказывал антивоспалительный эффект, более существенно уменьшал инфильтрацию легких провоспалительными клетками. Дополнительные исследования показали, что пептид КК-45 обладает более широким спектром антивирусного действия, подавляя не только репликацию RSV, но и другого оболочечного вируса – вируса гриппа. Учитывая, что данные соединения малотоксичны, это делает их перспективными для дальнейшей разработки на их основе антивирусных средств.