КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 18-74-10002

НазваниеПроектирование линейных и разветвленных пептидов и изучение их противовирусной активности в отношении респираторно-синцитиального вируса

РуководительШиловский Игорь Петрович, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научный центр "Институт иммунологии" Федерального медико-биологического агентства, г Москва

Период выполнения при поддержке РНФ 07.2018 - 06.2021 

Конкурс№30 - Конкурс 2018 года по мероприятию «Проведение исследований научными группами под руководством молодых ученых» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными.

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-110 - Общая и молекулярная микробиология; вирусология

Ключевые словаРеспираторные вирусы, пептиды, противовирусная активность, врожденный иммунитет, рецептор.

Код ГРНТИ34.25.23


СтатусУспешно завершен


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
Один из самых распространенных вирусных патогенов – респираторно-синцитиальный вирус (РСВ). Он поражает нижние дыхательные пути, что может приводить к бронхиолиту и/или пневмонии. Попытки создать профилактическую вакцину оказались неудачными. Для терапии РСВ в настоящее время применяется Виразол (Рибавирин), который вызывает многочисленные побочные эффекты. Разрабатываются препараты на основе вируснейтрализующих моноклональных антител: IGIV (Respigam), Palivizumab (Synagis), MEDI-524 (Numab). Однако клинические испытания еще продолжаются, а их дальнейшее использование будет ограничено высокой стоимостью. Одним из перспективных направлений исследований является использование природных пептидов (дефензинов и кателицидинов), или их синтетических аналогов в качестве противовирусных агентов. В настоящее время около 15 пептид-содержащих противовирусных препаратов, проходят клинические испытания. Главными преимуществами пептидных препаратов являются их широкий спектр противовирусной активности, объясняемый разнообразием механизмов действия и низкая токсичность. Тем не менее природные пептиды имеют недостатки, препятствующие их внедрению в медицину. Во-первых, природные пептиды являются малоустойчивыми соединениями, они быстро инактивируются протеазами сыворотки крови, что затрудняет их системное (например, внутривенное) применение. Во-вторых, получение природных пептидов, или их рекомбинантных форм является дорогостоящим, что делает их малодоступными. Кроме того, ввиду плейотропного биологического эффекта пептидов трудно установить точный механизм их действия. В данном проекте предлагается спроектировать и синтезировать библиотеку пептидных соединений с различной структурой и изучить их противовирусные свойства в отношении РСВ. Для решения проблем высокой стоимости природных пептидов предлагается химически синтезировать их укороченные аналоги. Данный подход к снижению издержек получения биологически активных пептидов описан в ряде современных публикаций активность [Lin и др., 2013; Qu и др., 2016]. Также в данном проекте предлагается повысить устойчивость синтетических пептидов путем искусственного синтеза разветвленных (дендримерных) пептидов, которые в природе не встречаются, поскольку в своей структуре содержат ε-амидные связи. Благодаря таким структурным отличиям ожидается, что дендримерные пептиды будут менее подвержены гидролизу протеазами сыворотки крови, что увеличит их стабильность и откроет перспективы не только для местного, но и для системного применения. Несмотря на десятилетия исследований жизненный цикл РСВ на молекулярном уровне изучен недостаточно. Секвенирование РНК-генома РСВ показало, что он кодирует 11 белков, три из которых задействованы в формировании оболочки вириона: малый гидрофобный (SH), гликопротеин (G) и фьюжн-белок (F). Установлено, что для присоединения и вхождения РСВ в клетку требуются лишь G и F белки. Считается, что первичный контакт вируса с клеткой осуществляется через белок G, а белок F затем опосредует слияние мембран вируса и клетки. Однако, инфицирование происходит, даже, если удалить G белок, но медленнее, в тоже время F белок абсолютно необходим для заражения. Многие попытки установить природу основного рецептора для РСВ увенчались успехом лишь в 2011 г. Рецептором оказался белок нуклеолин (Ncl) с молекулярной массой 100 кД, чьим лигандом является белок F вируса [Bilawchuk и др., 2017; Tayyari и др., 2011]. Учитывая вышеописанные факты, в рамках проекта предлагается изучить вероятные молекулярные механизмы противовирусной активности созданных линейных и дендримерных пептидов. Для этого будут задействованы молекулярно-биологические методы, например, т.н. метод «торможения ИФА», который с использованием моноклональных антител к нуклеолину (рецептору для РСВ) позволит установить влияние пептидов на данную био-мишень. Также будет изучена способность пептидов активировать противовирусный ответ клеток как in vitro, так и in vivo (более детальное описание методических подходов см. ниже). Таким образом, данный проект путем рационального дизайна пептидных соединений позволит не только создать соединение/соединения, перспективные для разработки противовирусных препаратов, но и пролить свет на возможные их механизмы действия.

Ожидаемые результаты
В ходе проекта будет осуществлен дизайн ряда пептидов как с линейной, так и с дендримерной структурами. Проектирование пептидов будет проводиться с учетом структуры рецептора для РСВ - белка нуклеолина (Ncl), чьим лигандом является белок F вируса. Спроектированные пептиды будут синтезированы твердофазным методом на автоматическом пептидном синтезаторе PS3 (Gyros Protein Technologies, USA) в формате Fmoc-химии. Для чего будут использованы специализированные смолы и защищенные аминокислоты. После очистки с помощью гель-проникающей и препаративной высоко-эффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), структура и чистота синтезированных соединений будет подтверждена методом масс-спектрометрии MALDI и аналитической ВЭЖХ. Всего будет спроектировано и синтезировано не менее 15-ти пептидов с различной структурой. При изучении биологических свойств созданных пептидных соединений первоначально будет изучена их цитотоксичность в МТТ-тесте с использованием перевиваемых культур клеток (культура клеток А549 – карцинома легкого человека). Для каждого пептида будет рассчитана IC50 – концентрация необходимая для гибели 50% клеток. После чего в экспериментах in vitro будет проведен первичный скрининг противовирусной активности по отношению к РСВ штамму А2. Противовирусная активность пептидов будет оценена в нетоксичных концентрациях по степени снижения титра вируса (титрование на монослое клеток по методу Рида-Менча), а также методом количественной ПЦР (по степени снижения количества вирусной РНК). Для этого РСВ будет обрабатываться соответствующими пептидами и высеваться на культуру чувствительных клеток МА-104 (эмбриональная почка обезьяны). Далее для наиболее активных вариантов пептидов детально будут изучены механизмы противовирусного действия. Для этого пептиды будут вводить в клетки в двух режимах. Во-первых, смешивать различные концентрации пептидов с вирусным материалом, совместно инкубировать, после чего оценивать жизнеспособность вируса путем его высевания на культуру чувствительных клеток МА-104, или путем определения количества вирусной РНК методом количественной ПЦР. Выявление противовирусных свойств при данном режиме введения пептидов будет свидетельствовать о том, что они воздействуют напрямую на вирионы, приводя к снижению их жизнеспособности. В соответствии со вторым режимом введения, синтезированные пептиды будут вносить в РСВ-чувствительную культуру клеток МА-104 в различных концентрациях, инкубировать и инфицировать клетки РСВ A2. Выявление противовирусных свойств при данном режиме введения будет свидетельствовать о том, что пептиды, скорее всего, воздействуют не на вирионы, а на сами клетки-мишени, активируя в них т.н. «антивирусное состояние» (повышается активность протеаз и РНКаз, разрушающих вирусные белки и РНК), либо блокируя на их поверхности рецепторы, необходимые для входа вириона в клетки. Для многих природных пептидов экспериментально было показано, что они активируют врожденный противовирусный иммунный ответ, предположительно посредством связывания с TLR-рецепторами. Поэтому в ходе будет оценена способность пептидов активировать врожденный иммунитет. Для этого клетки будут обработаны различными концентрациями пептидов, после чего, методом количественной ПЦР будет оцениваться активация генов противовирусной защиты. А именно гены: MX1, OAS1, IGS56, STAT1 и др. Согласно современным публикациям, для входа в клетки RSV использует поверхностный белок нуклеолин. Поэтому для определения способности синтезированных пептидов связываться с нуклеолином и тем самым конкурентно ингибировать связывание RSV с клеткой-мишенью будет проведена серия отдельных экспериментов. А именно, методом конкурентного ИФА будет изучаться способность пептидов ингибировать связывание моноклональных антител с нуклеолином. В заключении пептиды, обладающие максимальным противовирусным эффектом in vitro, будут изучены в экспериментах in vivo на модели RSV-инфекции у мышей. Синтезированные пептиды планируется вводить животным в двух режимах: в профилактическом (до инфекции) и терапевтическом (во время инфекции). Также будут изучены различные способы введения синтезированных пептидов. Будет опробован местный способ введения, например, интраназальный, или ингаляционный, который может оказаться оптимальным для респираторных вирусов. Помимо местного введения пептиды будут изучаться и при системном введении, например, при внутривенном, или подкожном, что позволить очень их устойчивость к протеазам сыворотки крови. Для оценки противовирусной активности пептидов у животных будет оценен ряд клинически-значимых параметров: функциональное состояние дыхательной системы, гистологические изменения в ткани легких, степень инфильтрации воспалительных клеток (лимфоциты, нейтрофилы) в дыхательные пути. Влияние изучаемых пептидов на вирусную нагрузку в ткани легких будет оценено двумя методами: во-первых, путем титрования смывов легких (бронхоальвеолярного лаважа) на монослое клеток МА-104, где будет оцениваться количество жизнеспособных вирионов; во-вторых, методом количественной ПЦР, где будет оцениваться количество вирусной РНК. Таким образом, в ходе проекта будут спроектированы пептиды с различной структурой (линейные и дендримерные) и проведено изучение их противовирусных свойств в отношении РСВ в экспериментах in vitro и in vivo. Кроме того, проведенные исследования позволят выявить предполагаемые механизмы противовирусного действия пептидов.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Один из самых распространенных вирусных патогенов - респираторно-синцитиальный вирус (РСВ). К настоящему моменту не создано эффективных, безопасных и при этом доступных средств его лечения и профилактики. Попытки создать профилактическую вакцину оказались неудачными, поэтому в настоящее время для лечения РСВ-инфекции применяется только виразол (рибавирин), однако он вызывает многочисленные побочные эффекты. Создаются препараты на основе моноклональных антител, однако их использование будет дорогостоящим. Одним из привлекательных направлений в создании антимикробных и антивирусных препаратов является применение природных пептидов и их синтетических аналогов в качестве фармацевтических агентов. Природные пептиды являются неотъемлемой частью врожденного иммунного ответа с бактерицидными, иммуномодулирующие и противовирусными свойствами. Однако их применение в медицинской практике сопряжено с рядом проблем. В частности, процесс выделения пептидов из природных источников затратен, искусственный синтез крупных природных пептидов обходится ненамного дешевле, не высокая стабильность - линейные пептиды легко разрушаются протеазами. Несмотря на вышеуказанные сложности создаются способы их преодоления. В первую очередь это картирование крупных пептидов и выявление в их структуре биологически-значимой части. Во-вторых, это стабилизация структуры пептидов за счет введения точечных аминокислотных замен или дополнительных химических связей. В-третьих - дендримеризация (синтез разветвленных структур) пептидов, посредством чего можно добиться повышения их стабильности. Таким образом, главная цель данной работы - проектирование линейных и дендримерных катионных пептидов и изучение их противовирусной активности в отношении РСВ. В задачи исследования на 1-й год работы входило: 1. дизайн пептидов с линейной и с дендримерной структурами, 2. изучение цитотоксичности пептидов в экспериментах in vitro, 3. первичный скрининг анти-РСВ активности пептидов в экспериментах in vitro. Из данных литературы известно, что противовирусной активностью как правило обладают пептиды, состоящие из позитивно заряженных аминокислот, обладающие способностью взаимодействовать с биологическими мембранами за счет наличия амфифильной структуры и имеющие α-спиральную структуру. Учитывая это было синтезировано 22 пептида из них 6 дендримерных разветвленных пептида. Синтез пептидов осуществлялся твердофазным методом. Очистка пептидов осуществлялась в две ступени: 1) методом гель-фильтрации и 2) методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Подтверждение структуры пептидов осуществляли методом масс-спектрометрии. В качестве контроля в исследованиях использовали природный пептид кателицидин - LL-37. Первоначально изучили цитотоксичность пептидов в МТТ-тесте на культуре клеток МА-104 (эмбриональная почка обезьяны). Контрольный пептид LL-37 ожидаемо обладал выраженным цитотоксическими свойствами. У 6-ти из 22-х пептидов коллекции выявлены цитотоксические свойства. Повышенной цитотоксичностью обладали пептиды, имеющие спиралевидную структуру, пептиды с т.н. «жирным хвостом» и пептиды с большой плотностью положительного заряда. По всей видимости данные пептиды оказывают повреждающее действие на мембрану клетки, приводя к потере её жизнеспособности. Для остальных 16-ти пептидов явных цитотоксических эффектов не обнаружено. Противовирусную активность оценивали in vitro на культуре клеток МА-104. Для этого пептиды в нетоксических концентрациях смешивали с РСВ штамм А2 и инкубировали в течение 2 ч после чего осуществляли титрование на монослое клеток МА-104. В качестве контроля вирус инкубировали с физиологическим раствором. После инкубации в течении 3 суток оценивали цитопатическое действие вируса на клетки методом световой микроскопии. Контрольный пептид LL-37 подавлял титр РСВ в 25 раз, что совпадает с ранее опубликованными данными. Из 22-х исследуемых пептидов 17 образцов статистически значимо подавляли титр вируса в среднем в 10 раз. При этом максимальной противовирусной активностью из линейных пептидов обладали катионный пептид NC-737, нейтральный спиралевидный пептид КО-1 и катионный пептид AS-35, которые снижали титр РСВ в 14, 25 и 33 раза, соответственно. Максимальной антивирусной активностью обладал дендримерный пептид LTP, снижавший титр РСВ в 100 раз. Такая высокая противовирусная активность LTP вероятно обусловлена значительным положительным зарядом пептида, который обеспечивается за счет наличия в его составе 8 остатков аргинина и 5 остатков лизина. Тем не менее, другой аргинин-богатый пептид, но с линейной структурой NC-810 (содержит 11 остатков аргинина) не обладает такими противовирусными свойствами. Скорее всего эти отличия могут быть обусловлены трехмерной структурой пептидов, первый из которых имеет разветвленную (дендримерную структуру), а последний – линейную спиралевидную. Дендримерная структура позволяет создавать кластер положительно заряженных аминокислот, что по всей видимости, является ключевым для взаимодействия с вирионом. В дополнительных экспериментах продемонстрировано дозозвисимое подавление титра РСВ пептидом LTP. Значения EC50 для LTP (концентрация, подавляющая титр вируса на 50%) составили 1,4±0,4 мкг/мл, что сопоставимо с активностью природного пептида LL-37 (ЕС50 = 0,7 – 5,6 мкг/мл). Цитотоксичность LTP в 200 раз ниже, чем у LL-37, что делает его перспективным для дальнейшего исследования.

 

Публикации

1. Шиловский И.П., Андреев С.М., Кожихова К.В, Никольский А.А., Хаитов М. Р. Перспективы использования пептидов против респираторно-синцитиального вируса Молекулярная биология, - (год публикации - 2019)

2. Шиловский И.П., Андреев С.М., Кожихова К.В., Барвинская Е.Д., Никольский А.А., Вишнякова Л.И., Хаитов М.Р. Противовирусная активность линейных и дендримерных катионных пептидов в отношении респираторно-синцитиального вируса Российский аллергологический журнал, №1, Т. 16, С. 180-182 (год публикации - 2019)

3. Шиловский И.П., Андреев С.М., Кожихова К.В., Барвинская Е.Д., Хаитов М.Р. Linear and dendrimeric peptides as perspective anti-virul agents Международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития», - (год публикации - 2019)

4. Шиловский И.П., Андреев С.М., Кожихова К.В., Барвинская Е.Д., Хаитов М.Р. Линейные и дендримерные пептиды как перспективные антивирусные средства Международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития», - (год публикации - 2019)


Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Известно, что многие природные пептиды проявляют выраженную антимикробную и противовирусную активность. Однако природные пептиды имеют довольно сложную структуру, часто содержат дисульфидные связи и малодоступны для практического применения из-за низкой стабильности и высокой токсичности. Данный проект посвящен созданию синтетических пептидов с линейной и дендримерной структурами, обладающими противовирусным свойствами в отношении респираторно-синцитиального вируса (РСВ). На данном этапе была дополнительно синтезирована коллекция из 6-ти дендримерных и линейных пептидов, обладающих потенциальным специфическим сродством к возможным терапевтическим мишеням при лечении РСВ, в частности на поверхности вируса к белку F и рецепторным белкам (нуклеолин C23, малая ГТФаза RhoA) на поверхности клетки человека, участвующим в слиянии вируса с клеткой. Изучена цитотоксичность данных пептидов и показано, что дендримерные пептиды с большой плотностью положительного заряда KK-42, KK-45 и KK-46 проявляли выраженный цитотоксический эффект. По всей видимости, данные пептиды оказывают повреждающее действие на мембрану клетки, приводя к потере её жизнеспособности. Скрининг антивирусной активности показал, что все 6 пептидов статистически значимо снижали титр РСВ в 5 – 10 раз. В рамках предыдущего этапа работы №1 было синтезировано 17 вариантов пептидов с анти-РСВ активностью. На втором этапе дополнительно было синтезировано 6 вариантов пептидов, при этом все из них проявляли аналогичный анти-РСВ эффект. Таким образом, по итогам работ этапов 1 и 2 было синтезировано 23 пептида с анти-РСВ активностью. На втором этапе работы мы сконцентрировались на исследовании механизмов антивирусной активность некоторых наиболее перспективных вариантов пептидов. Было показано, что денримерные пептиды KK-45, bLTP и KK-46 значительно ингибируют связывание РСВ и клеток-мишеней, т.к. предварительная инкубация их с клетками значительно предотвращала инфекцию. Также вышеуказанные пептиды обладают высокими значениями индексов безопасности СС50/ЕС50 = 50, 12,2 и 8,8. В одной из работ [Lambert и др., 1996] была продемонстрирована антивирусная активность пептидов из HRB-домена F-белка. Домены HRA и HRB участвуют в структурных перестройках белка F, что необходимо для слияния вируса с клеткой и инициации инфекционного процесса. Проектированные Lambert и коллегами [Lambert и др., 1996] пептиды связывались с доменом HRB и тем самым препятствовали инфекции. Учитывая это мы спроектировали линейный пептид КК-44 из HRA-домена F-белка (AA201-212), а также его модифицированный вариант с дендримерным пептидом (R4K2K) на N-конце молекулы– пептид КК-45. Совместная инкубация КК-45 (но не линейного КК-44) с РСВ при +4С в значительной степени препятствовала последующему инфекционному процессу. По всей видимости данный пептид взаимодействовал с вирионами и препятствовал функционированию белка F вируса. В пользу этой гипотезы свидетельствует тот факт, что КК-45 связывается с РСВ, что подтверждается данными ИФА-анализа. Однако линейный пептид КК-44, не обладающий значительными анти-РСВ свойствами, более интенсивно связывается с РСВ. Это может свидетельствовать о том, что связывание линейного пептида с РСВ не приводит к нарушению функционирования белка F. В то же время наличие разветвленной структуры на N-конце пептида КК-45 стерически препятствует нормальной функции белка F, а именно нарушает его структурную перестройку из префузионой в фузионную форму. В отдельном исследовании была изучена прямая вирулицидная активность пептидов. Наибольшим эффектом обладал дендримерный пептид bLTP. Другой дендрмерный пептид КК-45 также оказывал прямое вирулицидное действие на вирионы, но в меньшей степени. Крупные дендримерные пептиды с высокой плотностью позитивного заряда (+16 для bLTP и +8 для КК-45) могут оказывать прямое дестабилизирующее действие на оболочку РСВ, что в итоге приводит к снижению жизнеспособности вируса. Однако другой крупный дендримерный пептид КК-46 (заряд +18) не обладал такой активностью, по всей видимости, он проявляет свой анти-РСВ эффект по другому механизму. Данный пептид моделирует РСВ-связывающий участок поверхностного белка клеток RhoA, который играет роль рецептора для РСВ [Pastey и др., 2000] [Ortega-Berlanga и др., 2016]. Предположительно основной механизм действия КК-46 – это ингибирование процесса связывания вириона с клеткой-мишенью, что объясняет его высокую анти-РСВ активность в другом тесте – ингибирование прикрепления вируса к клетке. В ряде публикаций сообщалось о способности некоторых природных пептидов (например, дефензинов [Watford и др., 2003] [LeMessurier и др., 2016], мелиттина [Uddin и др., 2016] и LL-37 [Lai и др., 2011] активировать компоненты врожденного иммунитета и тем самым проявлять свой антивирусный эффект. Учитывая это, для некоторых наиболее активных пептидов мы также изучили их способность активировать врожденный иммунитет, в частности гены, ответственные за противовирусную защиту: IFNa2, MX1, ISG56, OAS1 и STAT1 [Sadler, Williams, 2008]. Проведенные исследования показали, что синтетические пептиды: bLTP, D12, KK-44, KK-45 и KK-46 не оказывают стимулирующего действия на гены противовирусной защиты. Эти данные согласуются с современными работами, свидетельствующими о том, что механизм действия пептидов зачастую не зависит от активации системы интерферонов [Currie и др., 2016]. Один из путей распространения РСВ – трансмиссия от одной инфицированной клетки к другой – неинфицированной [Battles, McLellan, 2019]. Данный способ распространения отчасти реализуется за счет формирования синцитиев – группы слившихся клеток. Учитывая это, мы изучили способность пептидов блокировать межклеточное распространения путем подсчета площади синцития. Проведенное исследование показало, что самое максимальное снижение площади синцитиев обеспечивал дендримерный пептид bLTP. Таким образом, наиболее перспективными для дальнейшего исследования в экспериментах in vivo являются: 1. дендримерный пептид KK-45, блокирующий вход вируса в клетку как за счет связывания с клеточным рецептором нуклеолином, так и за счет связывания с лигандами (предположительно белком F) на поверхности РСВ. 2. дендримерный пептид KK-46, блокирующий вход вируса в клетку за счет связывания с клеточным рецептором – RhoA. 3. дендримерный пептид bLTP, проявляющий анти-РСВ эффект по различным механизмам: как за счет связывания с клеточным рецептором нуклеолином, так и дестабилизации вирионов и препятствия межклеточной трансмиссии вируса от клетки к клетке. Примечательно, что наибольшим антивирусным эффектом обладают дендримерные пептиды, а не линейные. Возможно, это объясняется их большей устойчивостью к ферментам, разрушающим пептидные связи (протеазам), находящихся в биологических средах, что было подтверждено нами экспериментально. Дендримерные пептиды, в виду высокой протеолитической стабильности, являются перспективными соединениями для создания новых антивирусных препаратов.

 

Публикации

1. Кожихова К.В., Шиловский И.П., Шатилов А.А., Тимофеева А.В., Турецкий Е.А., Вишнякова Л.И., Никольский А.А., Барвинская Е.Д., Картикеян С., Смирнов В.В., Кудлай Д.А., Андреев С.М., Хаитов М.Р. Linear and dendrimeric antiviral peptides: design, chemical synthesis and activity against human respiratory syncytial virus Journal of Materials Chemistry B, No.12, V.8, P.2607-2617 (год публикации - 2020) https://doi.org/10.1039/c9tb02485a

2. Шиловский И.П., Андреев С.М., Кожихова К.В. Никольский А.А., Хаитов М.Р. Prospects For the Use of Peptides against Respiratory Syncytial Virus Molecular Biology, Volume 53, Issue 4, pp 484–500 (год публикации - 2019) https://doi.org/10.1134/S0026893319040125

3. Шиловский И.П., Никольский А.А., Никонова А.А., Гайсина А.Р., Вишнякова Л.И., Барвинская Е.Д., Ковчина В.И., Болотова С.И., Юмашев К.В., Брылина В.Е., Хаитов М.Р. Инфекция мышей респираторно-синцитиальным вирусом, вызывающая дисфункцию дыхательных путей, связанную с воспалением в ткани легких, как модель патологии человека Иммунология, Том 40, № 5 (год публикации - 2019)

4. Кожихова К.В. Шатилов А.А .; Тимофеева А.В.; Вишнякова Л.И.; Шиловский И.П .; Андреев С.М .; Хаитов М.Р. Cell-penetrating peptide dendrimers as multifunctional therapeutic agents Allergy, V. 74. P. 715 (год публикации - 2019)

5. Шиловский И., Андреев С., Кожихова К., Барвинская Е., Никольский А., Хаитов Р., Кудлай Д., Хаитов М. Dendrimeric peptide LTP exhibits potent antiviral properties against respiratory syncytial virus Allergy, V. 74, P. 790 (год публикации - 2019)

6. Шиловский И.П., Андреев С.М., Кожихова К.В., Барвинская Е.Д., Хаитов М.Р. Линейные и дендримерные пептиды как перспективные антивирусные средства Материалы международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития», С. 179 (год публикации - 2019)


Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Известно, что многие природные пептиды проявляют выраженную антимикробную и противовирусную активность. Однако природные пептиды имеют довольно сложную структуру, часто содержат дисульфидные связи и малодоступны для практического применения из-за низкой стабильности и высокой токсичности. Данный проект посвящен созданию синтетических пептидов с линейной и дендримерной структурами, обладающими противовирусным свойствами в отношении респираторно-синцитиального вируса (RSV). На предыдущем этапе работы было показано, что из 26 протестированных варианта дендримерные пептиды KK-45, bLTP и KK-46 обладают максимально выраженными антивирусными свойствами и обладают высокими значениями индексов безопасности СС50/ЕС50 = 50, 12,2 и 8,8. Исследования механизмов антивирусного действия показано, что КК-45 взаимодействует с вирионами и препятствует функционированию белка F вируса. Дендримерный пептид КК-46 моделирует RSV-связывающий участок поверхностного белка клеток RhoA, который играет роль рецептора для RSV [Pastey и др., 2000] [Ortega-Berlanga и др., 2016]. Предположительно основной механизм действия КК-46 – это ингибирование процесса связывания вириона с клеткой-мишенью. Наиболее вероятный механизм действия bLTP – конкурентное ингибирование нуклеолина – рецептора для RSV. В рамках третьего этапа проведено исследование антивирусных эффектов трех дендримерных пептидов КК-45, bLTP и КК-46 в экспериментах in vivo на модели RSV-инфекции мышей. Синтезированные пептиды вводили животным в лечебно-профилактическом режиме (т.е. первое введение пептидов осуществлялось за несколько часов до инфекции, и продолжалось в течение нескольких дней после инфицирования мышей вирусом). Учитывая, что механизм действия пептидов связан либо блокированием входа вируса в клетку, либо с прямым вирулицидным действием, то изучение профилактического режима введения сочли не целесообразным, т.к. для реализации пептидами своих антивирусных свойств необходим прямой их контакт с патогеном. Также с учетом механизмов действия пептидов они вводились мышам интраназально, т.е. в очаг репликации вируса. Перед проведением исследований на модели RSV-инфекции были предварительно проведены токсикологические исследования in vivo с целью установить переносимые и летальные дозы пептидов. Максимальные переносимые дозы для пептидов bLTP, КК-46 и КК-45 составили 162,5 мг/кг. На основе данных о гибели животных рассчитаны летальные дозы: для bLTP рассчитанная LD50 = 325 мг/кг; для КК-46 LD84 = 325 мг/кг; для КК-45 LD67 = 325 мг/кг. Согласно этим данным, пептиды bLTP, КК-46 и КК-45 можно отнести к классу малотоксичных соединений по классификации токсичности К.К. Сидорова, и следовательно изучать их антивирусные свойства в широком диапазоне доз. Проведенные исследования на модели RSV-инфекции у мышей показали, что интраназальное применение дендримерных пептидов КК-45, bLTP и КК-46 существенно снижает вирусную нагрузку в легких, что подтверждается методами количественной ПЦР и титрования на монослое клеток. При этом максимальным антивирусным эффектом обладает дендримерный пептид КК-46, которым снижает вирусную нагрузку в легких в 17 раз, что согласуется с ранее проведенными исследованиями in vitro. Дендримерные пептиды КК-45, bLTP и КК-46, снижая вирусную нагрузку в легких, тем самым способствовали уменьшению воспаления респираторного тракта, что выражалось в снижении степени инфильтрации легких провоспалительными клетками (главным образом макрофагами и лимфоцитами). Стоит отметить, что несмотря на то, что максимальным антивирусным эффектом обладает пептид КК-46, максимальное уменьшение воспаления достигается при использовании bLTP. Это свидетельствует о том, что пептиду bLTP могут быть присущи не только антивирусные, но и антивоспалительные свойства. Учитывая, что оболочечные вирусы имеют сходство в строении вириона и в механизмах проникновения в клетку, то нами была изучены способность этих пептидов проявлять антивирусный эффект в отношении вируса гриппа в экспериментах in vitro на культуре клеток MDCK. Изучение противовирусной активности показало, что только пептид КК-45 специфически ингибировал размножение вируса гриппа А/Калифорния/04/09 (пндм H1N1). Значения ИК50 для KK-45 в составили 23,24±7,03 мкг/мл, при этом индекс селективности составил величину порядка 13,8. Таким образом, пептид КК-45 обладает более широким антивирусным спектром действия подавляя как репликацию RSV, так и вируса гриппа в то же время пептиды bLTP и KK-46 оказывают более узкий антивирусный эффект, подавляя репликацию RSV, но не вируса гриппа. Это объясняется тем, что пептид bLTP конкурентно воздействует на белок нуклеолин (C23), а пептид КК-46 на белок ГТФазу (RhoA), которые являются рецепторами для RSV. В то же время пептид КК-45 в большей степени воздействует на лиганды вириона, что обеспечивает более широкий спектр антивирусной активности в отношении структурно сходных патогенов (оболочечные вирусы). Дендримерный пептид КК-45 был дополнительно изучен на модели RSV-инфекции мышей в сравнении с двумя контрольными пептидами: КК-44 – линейна форма пептида КК-45, D12 – короткий дендримерный пептид. Проведенные исследования показали, что интраназальное применение дендримерного пептида КК-45 в наибольшей степени снижало вирусную нагрузку в легких, что подтверждено методами количественной ПЦР (2,6 раза) и титрования на монослое клеток (в 15 раз). При этом линейная форма этого пептида КК-44 не влияла на репликацию вируса, а короткий дендримерный пептид D12 лишь незначительно уменьшал количество RSV в респираторном тракте. Подавление вирусной нагрузки под действием пептида КК-45 приводило к заметному уменьшению RSV-индуцированного воспаления в легких, что выражалось в существенном снижении числа инфильтрирующих ткань легких клеток. Наблюдали 2-кратное снижение количества провоспалительных клеток в БАЛ (главным образом макрофагов и лимфоцитов) и в перибронхиальных инфильтратах, а также сокращалась площадь самих инфильтратов в ткани легких. О снижении воспаления также свидетельствовало более чем 2-кратное уменьшение экспрессии провоспалительных цитокинов IFNg и TNFa в клетках БАЛ. Несмотря на уменьшение вирусной нагрузки и степени воспаления легких у мышей получавших КК-45 не отмечено восстановления дыхательной функции легких и толщины стенок бронхов. Вероятно, для нормализации таких нарушений требуется более длительный восстановительный период. Таким образом, проведенные на модели RSV-инфекции у мышей исследования показали, что дендримерные пептиды КК-45, bLTP и КК-46 обладают антивирусными свойствами. Максимальный антивирусный эффект оказывал пептид КК-46, однако пептид bLTP дополнительно оказывал антивоспалительный эффект, более существенно уменьшал инфильтрацию легких провоспалительными клетками. Дополнительные исследования показали, что пептид КК-45 обладает более широким спектром антивирусного действия, подавляя не только репликацию RSV, но и другого оболочечного вируса – вируса гриппа. Учитывая, что данные соединения малотоксичны, это делает их перспективными для дальнейшей разработки на их основе антивирусных средств.

 

Публикации

1. Никонова А., Шиловский И., Галицкая М., Соколова А., Сундукова М., Дмитриева-Посоко О., Митин А., Комогорова В., Литвина М., Шарова Н., Жернов Ю., Кудлай Д., Дворников А., Курбачева О., Хаитов Р., Хаитов М. Respiratory syncytial virus upregulates IL-33 expression in mouse model of virus-induced inflammation exacerbation in OVA-sensitized mice and in asthmatic subjects Cytokine, (138) 155349 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.1016/j.cyto.2020.155349

2. Шиловский И.П., Юмашев К.В., Никольский А.А., Вишнякова Л.И., Хаитов М.Р. Molecular and cellular mechanisms of Respiratory Syncytial Viral infection: using murine models to understand human pathology. Biochemistry, Vol. 86, No. 3, pp. 290-306. (год публикации - 2021) https://doi.org/10.1134/S0006297921030068

3. Шиловский И.П., Кожихова К.В., Андреев С.М., Смирнов В.В., Барвинская Е.Д., Вишнякова Л.И., Никольский А.А., Кудлай Д.А., Хаитов М.Р. Dendrimeric form of the peptide from antigenic zero- site of F protein exhibit antiviral effect against respiratory syncytial virus Allergy, Allergy, vol. 75, p. 140 (год публикации - 2020)


Возможность практического использования результатов
В ходе проекта созданы три дендримерных пептида KK-45, bLTP и KK-46, которые обладают выраженными антивирусными свойствами по отношению к RSV. Антивирусные свойства пептида показаны как в экспериментах in vitro, так и in vivo. В экспериментах in vivo мы показали, что интраназальное применение пептидов существенно снижает вирусную нагрузку в легких, что подтверждается методами количественной ПЦР и титрования. При этом максимальным антивирусным эффектом обладает дендримерный пептид КК-46, который снижает вирусную нагрузку в легких в 17 раз. Дендримерные пептиды КК-45, bLTP и КК-46, снижая вирусную нагрузку в легких, тем самым способствовали уменьшению воспаления респираторного тракта, что выражалось в снижении степени инфильтрации легких провоспалительными клетками (главным образом макрофагами и лимфоцитами). Для пептида КК-45 было дополнительно показано, что он проявляет антивирусный эффект по отношению к вирусу группа, что делает его более универсальным антивирусным агентом. Проведены токсикологические исследования этих пептидов в экспериментах in vivo и показано, что они относятся к классу малотоксичных соединений (ЛД50 более 150 мг/кг). Таким образом, проведенные исследования показали, что дендримерные пептиды КК-45, bLTP и КК-46 обладают антивирусными свойствами. Учитывая, что данные соединения малотоксичны, это делает их перспективными для дальнейшей разработки на их основе антивирусных средств.