Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Согласно плану, в первый год работы по проекту велись исследования по оценке структурно-функциональных и молекулярно-клеточных особенностей миокарда камер сердца в норме и при развитии сердечной недостаточности, вызванной сахарным диабетом (СД) 1 типа. Эксперименты были выполнены в соответствии с принципами, изложенными в Директиве 2010/63/ЕU. Было выполнено моделирование СД 1 типа с высоким уровнем гипергликемии (6 недель аллоксанового диабета). Индукция аллоксан-индуцированного СД (1 типа) проводилась путем трех внутрибрюшинных инъекций аллоксана в дозе 100 мг/кг в течение одной недели (Данилова и Гетте, 2014) на самцах крыс линии Wistar в возрасте 12-13 недель. Через 6 недель после первой инъекции аллоксана животных выводили из эксперимента для оценки изменений миокарда при помощи биохимических, гистологических и гистохимических методов анализа, исследований на одиночных кардиомиоцитах и сократительных белках. Биохимическое исследование крови Через 6 недель после моделирования аллоксанового диабета в крови диабетических крыс достоверно (p<0.05) увеличилось содержание глюкозы (примерно в 3 раза) и гликированного гемоглобина (примерно на 50%) по сравнению с показателями интактной группы. Было показано, что СД1 сопровождается изменениями показателей липидного обмена (увеличение на 30% содержания холестерина, в 5 раз – холестерина ЛПНП, уменьшение на 30% холестерина ЛПВП), способствующими развитию атеросклеротического процесса. Было показано, что развитие СД1 сопровождается явлением цитолиза, подтвержденным повышением активности аминотрансфераз в плазме крови. Анализ ЭКГ и показателей артериального давления Было доказано развитие сердечной недостаточности в изучаемом периоде СД 1 типа. Анализ ЭКГ in vivo позволил обнаружить не только функциональные (нарушение процессов реполяризации), но и органические изменения миокарда в виде признаков перегрузки и гипертрофии левого желудочка (ЛЖ) и правого предсердия. По анализу гемодинамических параметров было установлено развитие артериальной гипертензии у крыс с СД1. Статистически значимое уменьшение пульсового давления (на 20%) у крыс группы СД1 показывает на снижение сердечного выброса вследствие вероятного увеличения общего периферического сопротивления сосудов и повреждения миокарда. Анализ структурных изменений в камерах сердца Для анализа морфофункционального состояния камер сердца была проведена общая гистологическая оценка тканей сердца на препаратах, окрашенных гематоксилином и эозином. Окрашивание пикросириус красным проводилось для выявления коллагеновых волокон при использовании лазерной конфокальной микроскопии. Морфометрическое исследование показало увеличение толщины стенок сердечных камер у животных с СД1 по сравнению с интактными животными, однако статистически значимо было выражено только для ЛЖ. Для группы крыс с СД1 было отмечено уменьшение диаметра кардиомиоцитов во всех камерах, но достоверные изменения отмечались также только для ЛЖ. Содержание коллагена при СД1 снизилось как в левых, так и в правых камерах сердца по сравнению с интактными животными. Анализ зависимости содержания коллагена от уровня гликированного гемоглобина внутри группы СД1 показал тенденцию к увеличению содержания коллагена в предсердиях и, наоборот, его уменьшение в желудочках при увеличении количества HbA1c в крови, что может свидетельствовать о различной скорости развития фиброза миокарда в зависимости от длительности гипергликемии и степени выраженности СД. Исследование динамики цитозольного кальция и сократительной функции одиночных кардиомиоцитов Одиночные кардиомиоциты были получены с применением стандартной методики перфузии сердца по Лангендорфу. Было исследовано нарушение динамики цитозольного кальция (изменение амплитуды, время достижения пика, время спада концентрации цитозольного кальция, максимальные скорости нарастания и спада) и механической функции (изменение амплитуды, время достижения пика сокращения, время расслабления, максимальные скорости сокращения и расслабления) кардиомиоцитов предсердий и желудочков в ненагруженном режиме сокращения при СД1. У животных с аллоксановым СД наблюдалось замедление временных характеристик сокращения и расслабления, причем достоверные различия были выявлены только для миоцитов ЛЖ, что приводило к увеличению регионального градиента сократительной функции одиночных кардиомиоцитов ЛЖ и ПЖ. Наличие неоднозначных результатов о влиянии СД1 на сократительную функцию кардиомиоцитов (увеличение амплитуды сокращений) может свидетельствовать о возможных компенсаторных механизмах, развивающихся на фоне патологии. Исследование изменение характеристик актин-миозинового взаимодействия и изоформного состава белков саркомера Было исследовано влияние СД1 на кальциевую регуляцию актин-миозинового взаимодействия в миокарде ЛЖ и ПЖ. Для этого проанализирована зависимость скорости скольжения F-актина и NTF (нативного тонкого филамента), экстрагированных из ЛЖ и ПЖ здоровых крыс, по миозину из ЛЖ и ПЖ. Метод искусственной подвижной системы (ИПС) был использован для исследования взаимодействия сократительных и регуляторных белков саркомеров на уровне молекулярных ансамблей (Matyushenko, et al., 2016). Обнаружено, что при СД1 значительно снижается кальциевая чувствительность скорости NTF на 0.2 pCa и их максимальная скорость по миозину обоих желудочков на 30%. Таким образом, в рамках первого года работы над проектом были получены новые данные о структурно-функциональных особенностях изменения миокарда при СН, вызванной СД 1 типа. Полученные результаты могут быть использованы для дальнейших исследований нарушения работы сердца при СД и способов ее восстановления. Кроме того, для выполнения исследований во второй год работы по влиянию преднагрузки на сократительную активность одиночных кардиомиоцитов было разработано программное обеспечение для управления системой цифрового микроманипулирования в среде разработки LabVIEW. Данное ПО позволяет прикладывать к кардиомиоциту управляемую преднагрузку путём синхронного перемещения прикрепленных к клетке карбоновых волокон. Тестирование показало, что разработанное ПО способно управлять цифровыми микроманипуляторами с максимальной рассинхронизацией выполнения команд в одну микросекунду (Volzhaninov et al., 2019). Предварительное исследование на кардиомиоцитах здорового миокарда показало, что что механическая нагрузка может изменять региональный градиент сократительных свойств миоцитов из различных слоев ЛЖ (Khokhlova et al., 2019). Всего по результатам первого года было подготовлено и опубликовано 9 работ, из них 6 публикаций находятся в печати. Из данных работ 3 публикации входит в базы Web of Science/Scopus, 1 из них относятся к квартилю Q1, 6 работ входит в базу РИНЦ.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Работу в отчетном периоде можно разделить на 2 блока. Первый блок относится к продолжению работы первого года по СД1, второй блок – исследование структурно-функционального состояния миокарда при СД 2 типа (ранняя стадия, 6 недель). Продолжение работы по исследованию структурно-функционального состояния миокарда при сердечной недостаточности, вызванной СД 1 типа Эксперименты были выполнены в соответствии с принципами, изложенными в Директиве 2010/63/ЕU. Для работы по первому блоку было выполнено моделирование СД 1 типа с высоким уровнем гипергликемии (6 недель аллоксанового диабета). Показано, что у здоровых животных мозговой натрийуретический пептид (МНП) содержится в предсердиях, особенно в правом предсердии, но не в желудочках. При СД1 содержание МНП в в правом предсердии достоверно уменьшалось, но происходило его увеличение (появление) в желудочках. Обнаружено, что у крыс с СД1 коллагеновые структуры миокарда сохраняются, ширина и ориентация сети коллагеновых волокон у животных с СД1 не меняется. Полученные результаты помогают исключить гипотезу о превалировании деградации коллагеновых волокон через глюконеогенез над фибротическими процессами при развитии СД1 в данной экспериментальной модели СД. Для анализа механизмов развития гипертрофии стенок предсердий и желудочков крыс с СД1 при уменьшении размеров кардиомиоцитов и неизмененном содержании соединительной ткани (результаты первого года работы над Проектом) мы проанализировали степень гидратации миокарда. Обнаружено уменьшение степени гидратации миокарда миокарда левого предсердия и левого желудочка, что позволяет исключить отек в качестве причины гипертрофии стенок сердца при СД1. Исследовано влияние механической нагрузки, создаваемой карбоновыми волокнами, на профиль деформации саркомеров кардиомиоцитов без изменения конечно-диастолической длины и силогенерация кардиомиоцитов при их растяжении карбоновыми волокнами (зависимость Франка-Старлинга). У животных с СД1 уменьшалась амплитуда силы кардиомиоцитов свободной стенки левого и правого желудочков, но увеличивалась амплитуда силы кардиомиоцитов межжелудочковой перегородки. В большей степени при СД1 нарушалась длинозависимая активация миофиламентов кардиомиоцитов свободной стенки правого желудочка. Кроме того, обнаружено отличие в длинозависимой активации миофиламентов субэндокардиальных и субэпикардиальных кардиомиоцитов ЛЖ. Эти результаты могут объяснять большой разброс данных в рамках одной камеры (Khokhlova et al., 2020). Показано, что при СД1 происходит гликозилирование миозина, и меняется степнь фосфорилирования белков тонкой нити. Для исследования влияния СД1 на кальциевую регуляцию актин-миозинового взаимодействия в миокарде проанализирована зависимость скорости скольжения F-актина и тонких нитей, содержащих актин, тропонини и тропомиозин, по миозину предсердий и желудочков в искусственной подвижной системе. Обнаружено, что при СД1 значительно снижается скорость скольжения актина и тонких нитей по миозину предсердий, но, в отличие от миозина желудочков не меняется кальциевая чувствительность скорости. Исследование структурно-функционального состояния миокарда при СД 2 типа Выполнено моделирование стрептозотоцин/никотинамид-индуцированном СД (6 недель СД2). СД2 сопровождался изменением показателей липидного обмена, способствующими развитию атеросклеротического процесса; а также явлением цитолиза, подтвержденным повышением активности аминотрансфераз в плазме крови. У животных с СД2 наблюдалось достоверное увеличение содержания кортикостерона в плазме крови. Для оценки сердечно-сосудистой системы in vivo у исследуемых животных были измерены показатели артериального давления и ЭКГ. Показано нарушение процессов деполяризации и реполяризации в сердце при СД2. Обнаружено, что 6 недель экспериментального СД2 в отличие от 6 недель экспериментального СД1 не приводит к явному нарушению гемодинамических показателей целого организма. Для анализа морфофункционального состояния камер сердца была проведена общая гистологическая оценка тканей сердца на препаратах, окрашенных гематоксилином и эозином. Окрашивание пикросириус красным проводилось для выявления коллагеновых волокон при использовании лазерной конфокальной микроскопии. Обнаружено уменьшение толщины стенок камер предсердий и правого желудочка у животных с СД2 по сравнению с контролем, в отличие от СД1, где наблюдалась гипертрофия миокарда (см. результаты работы первого года). У крыс с СД2 достоверно уменьшился диаметр кардиомиоцитов всех камер кроме правого предсердия, и уменьшалось количества кардиомиоцитов, как и при СД1. При СД2 увеличилось содержание коллагена в желудочках, но не предсердиях сердца по сравнению с контрольной группой. При СД2 содержание МНП увеличивалось во всех камерах, кроме правого предсердия, в которой, наоборот, содержание МНП уменьшалось. Сравнение групп СД2 и СД1 показало большее содержание МНП во всех камерах (достоверно для предсердий) при СД2, чем при СД1. Исследовано нарушение динамики цитозольного кальция и сократительной функции кардиомиоцитов предсердий и желудочков в ненагруженном режиме сокращения при СД2. Показано, что при СД2 в большей степени изменяются характеристики цитозольного кальция и параметры сократительного цикла одиночных кардиомиоцитов желудочков, чем предсердий. Обнаружено достоверное увеличение частоты возникновения Са2+ спарков при СД2 в миоцитах межжелудочковой перегородки. При СД2 наблюдалась выраженная дезорганизация t-тубулярной сети желудочков, особенно в правом желудочке, но не в кардиомиоцитах предсердий, что может объяснить большее нарушение кальциевой динамики и сократительной функции кардиомиоцитов желудочков. Показано, что СД2 оказывает более слабое влияние на актин-миозиновое взаимодействие в желудочках, чем СД1. При СД2 снижается скорость скольжения тонких нитей, и не меняется кальциевая чувствительность скорости скольжения актина по миозину.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Работу в отчетном периоде можно разделить на 2 блока. Первый блок относится к продолжению работы второго года по исследованию влияния кратковременного СД2 6 недель на структурно-функциональные особенности миокарда предсердий и желудочков, второй блок – по исследованию влияния продолжительного СД 2 типа 12 недель. Продолжение работы по исследованию структурно-функционального состояния миокарда при сердечной недостаточности, вызванной СД 2 типа (6 недель) Эксперименты были выполнены в соответствии с принципами, изложенными в Директиве 2010/63/ЕU. Для работы по первому блоку было выполнено моделирование кратковременного СД 2 типа (6 недель стрептозотоцин-никотинамид-индуцированного СД). Показано, что несмотря на артериальную нормотензию, концентрация кортикостерона и альдостерона в плазме крови у диабетических животных увеличивается. Иммуногистохимическим методом показано, что содержание предсердного натрийуретического пептида (ПНП) при кратковременном СД2 недостоверно увеличивался в предсердиях, имеет тенденцию к уменьшению в желудочках, однако значимых различий между диабетической и контрольной группами обнаружено не было. Получены новые экспериментальные данные о нарушении длинозависимости силы сокращения (закон Франк-Старлинга), проведен анализ индексов жесткости и сократимости – углы наклонов «конечно-диастолическая длина-сила», «конечно-систолическая длина-сила» и временных характеристик силогенерации одиночных кардиомиоцитов при кратковременном СД2. Кардиомиоциты свободных стенок левого и правого желудочков (ЛЖ и ПЖ) при СД2 6 недель оказались более чувствительными к механической нагрузки, приложенной к клетке, по сравнению с интактными миоцитами. Сравнение коэффициентов наклонов прямых «сила-длина» показали наибольшее нарушение длинозависимой активации миофиламентов кардиомиоцитов ПЖ. Также мы показали, что существуют отличия в длинозависимой активации миофиламентов кардиомиоцитов папиллярной мышцы и кардиомиоцитов свободной стенки желудочка, а трансмуральные различия механической функии кардиомиоцитов выражены больше по сравнению с апикобазальными различиями. Эти результаты необходимо учитывать при исследовании межкамерной неоднородности и могут объяснять большой разброс данных в рамках одной камеры. Проанализированы посттрансляционные модификации белков кардиомиоцита (фосфорилирование и карбонилирование) предсердий и желудочков при СД2 6 недель. Показано более слабое влияние кратковременного СД2 на Са2+ регуляцию актин-миозинового взаимодействия по сравнению с СД1. Обнаружено, что при СД2 степень гликозилирования тяжелых и легких цепей миозина, а также белков NTF не меняется, а степень фосфорилирования исследуемых белков изменилась по-разному в разных камерах сердца. Исследование структурно-функционального состояния миокарда при продолжительном СД 2 типа (12 недель) Выполнено моделирование стрептозотоцин/никотинамид-индуцированном СД (12 недель СД2), которое сопровождается гипергликемией, превышающей характерный для кратковременного СД2 субкомпенсированный уровень. СД2 сопровождался изменением показателей липидного обмена, способствующими развитию атеросклеротического процесса; а также явлением цитолиза, подтвержденным повышением активности аминотрансфераз в плазме крови. У животных с СД2 наблюдалось достоверное увеличение содержания кортикостерона и альдостерона в плазме крови. Для оценки сердечно-сосудистой системы in vivo у исследуемых животных были измерены показатели артериального давления и ЭКГ. У животных с продолжительным СД2 в отличие от кратковременного СД2 наблюдались признаки гипертрофии предсердий и нарушении процессов реполяризации в желудочках. СД2 12 недель не влиял на показатели артериального давления, однако, увеличил среднюю скорость кровотока в хвосте животных. Увеличение линейной скорости кровотока в хвосте животных с продолжительным СД2 может быть обусловлено сужением просвета сосудов при прогрессировании атеросклеротических процессов. Для анализа морфофункционального состояния камер сердца была проведена общая гистологическая оценка тканей сердца на препаратах, окрашенных гематоксилином и эозином. Окрашивание пикросириус красным проводилось для выявления коллагеновых волокон при использовании лазерной конфокальной микроскопии. В отличие от кратковременного СД2, у животных с СД2 12 недель по сравнению с интактной группой увеличивается толщина стенок камер предсердий и диаметр кардиомиоцитов ЛЖ. Содержание коллагена в камерах сердца при СД2 12 недель достоверно увеличилось в правом предсердии, в то время как не было отмечено достоверных изменений в других отделах сердца. Исследованы изменения механической функции и динамики цитозольного кальция (амплитудные и временные характеристики) одиночных кардиомиоцитов предсердий и желудочков при продолжительном СД2. Как и при раннем СД2 в большей степени изменяются характеристики цитозольного кальция и параметры сократительного цикла одиночных кардиомиоцитов желудочков, чем предсердий, однако в отличие от кратковременного СД2 6 недель не обнаружено выраженной дезорганизации t-тубулярной системы. При помощи уникальной методики карбоновых волокон получены новые экспериментальные данные о нарушении длинозависимости силы сокращения (закон Франк-Старлинга), проведен анализ индексов жесткости и сократимости – углы наклонов «конечно-диастолическая длина-сила», «конечно-систолическая длина-сила» и временных характеристик силогенерации одиночных кардиомиоцитов при длительном СД2. Показано, что в отличие кратковременного СД2 увеличивалась жесткость кардиомиоцитов ПЖ. Для интерпретации результатов по неоднородности проявления СД2 в нарушении механической функции кардиомиоцитов предсердий и желудочков были проанализированы изменения механических характеристики актин-миозинового взаимодействия (скорость движения тонкому филамента по сердечному миозину и сила, развиваемая миозиновыми поперечными мостиками) и нарушения кальциевой регуляции сокращений кардиомиоцитов на молекулярном уровне (исследования соотношения рСа- скорость движения тонкого филамента по сердечному миозину). При СД 2 типа продолжительностью 12 недель замедляется цикл поперечного мостика миозина, что приводит к уменьшению скорости скольжения F-актина и филаментов по миозинам в ИПС, уменьшается кальциевая чувствительность актин-миозинового взаимодействия, причем данные изменения выражены сильнее в желудочках, чем в предсердиях. Данные изменения могут быть следствием сочетанного влияния изменения степени фосфорилирования регуляторных белков тонкого филамента – тропомиозина, TnT и TnI.