Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Черепно-мозговая травма (ЧМТ) приводит к множественным патологическим процессам, затрагивающим различные клетки мозга. Одним из следствий ЧМТ и массированной клеточной гибели может быть накопление в интерстициальной и спинномозговой жидкостях токсических факторов. Процесс накопления, вызывающий так называемое вторичное повреждение, не является скоротечным и протекает зачастую в течение дней и недель. Недавно мы обнаружили, что спинномозговая жидкость (СМЖ) крыс, полученная после ЧМТ вызывает гибель клеток глиомы крысы C6. Такое действие было обусловлено содержанием в СМЖ травмированных животных токсичных белковых комплексов. Одним из белков, которые могут принимать участие в формировании токсичных комплексов является белок глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа (ГАФД). Важной особенностью белка ГАФД является его способность формировать комплексы различной структуры в ответ на стрессовые условия. Причем такие комплексы могут формироваться как внутри клеток, так и в межклеточном пространстве, куда белок может попасть вследствие массовой гибели клеток. Ранее мы уже показали, что агрегацию ГАФД в межклеточном пространстве можно остановить с помощью производного гидрокортизона - вещества RX624. D отчетном году на крысиной модели ЧМТ нам удалось продемонстрировать терапевтические возможности препарата RX624, блокирующего формирование агрегатов с участием белка ГАФД в СМЖ травмированных животных. Важным достижение в первый год нашей работы можно назвать создание удобной клеточной модели вторичного повреждения после ЧМТ. В качестве токсического фактора в созданной нами модели применяется СМЖ крыс после ЧМТ. Культуру клеток глиобластомы крысы C6 инкубировали с СМЖ, затем анализировали такие параметры клеточной популяции, как апоптоз, пролиферация, выживаемость. При этом такая модель отлично подходила для тестирования эффективности действия препаратов, нацеленных на терапию вторичных повреждений. Мы полагаем, что важную роль в снижении тяжести посттравматических патологических осложнений может играть белок Hsp70. Шаперон Hsp70 известен своей цитопротекторной активностью, и поэтому крайне перспективным может оказаться подход, предполагающий лекарственное повышение его концентрации в клетках, подверженных действию про-апоптозных и про-воспалительных факторов. Поэтому другим значимым результатом нашей годовой работы можно считать открытие и успешную апробацию нового соединения, которое вызывает синтез и накопление в клетках белка Hsp70, таким соединением оказалось производное пироллилазина КД-29 из коллекции Уральского федерального университета. Важным преимуществом найденного нами соединения является его стабильность. Новое соединение было проверено нами с помощью панели моделей вторичного повреждения после ЧМТ. В качестве первой модели мы использовали клетки глиобластомы крысы C6, которые инкубировали с СМЖ травмированных крыс. В этом случае препарат КД-29 добавляли к клеткам одновременно с СМЖ крыс. Вторая использованная нами модель позволяла оценить действие препарата при реабилитационной терапии крыс после ЧМТ - КД-29 вводили подопытным животным внутрибрюшинно в течение 4 недель после травмы. Наконец, третья модель заключалась в анализе действия СМЖ травмированных крыс, получавших инъекции КД-29, на необработанные клетки глиобластомы крысы C6. Найденный нами препарат продемонстрировал эффективность во всех тестах. Клетки, обработанные КД-29 обладали повышенной устойчивостью к действию СМЖ травмированных крыс и демонстрировали близкий к нормальному уровень пролиферации. Применение КД-29 в качестве терапевтического агента после ЧМТ позволило сохранить двигательную функцию подопытным животным и заблокировать интенсивную нейродегенерацию. СМЖ травмированных животных, прошедших курс терапии с применением КД-29 оказалось значительно менее токсично в сравнении с СМЖ травмированных крыс, не получавших инъекции препарата.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
В защите клеток от патогенных процессов, в том числе, вызванных черепно-мозговой травмой (ЧМТ) важную роль играет белок теплового шока Hsp70, который участвует в блокировании разнообразных путей апоптоза, является ключевым элементом клеточной системы распознавания и деградации белков с нарушенной конформацией. К концу второго года реализации проекта мы завершили работы по апробации производного пирролилазаина PQ-29, вызывающего активацию синтеза Hsp70, в качестве терапевтического средства для лечения пост-травматического состояния. Эти исследования, начатые еще в первый год работы над проектом, на второй год включили в себя получение дополнительных данных о механизме действия PQ-29, изучение его терапевтического действия, основанного на индукции синтеза Hsp70. В качестве еще одной потенциальной мишени для терапии пост-травматического состояния мы предполагали белок глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа (ГАФД). За второй год работы над проектом мы завершили сбор информации об использовании препаратов, нацеленных на ГАФД для терапии широкого спектра социально значимых заболеваний (включая онкологические и нейродегенеративные заболевания, диабет, и вторичные повреждения после ЧМТ). Подобные данные были впервые обобщены нами и к настоящему времени опубликованы в международном журнале Pharmaceutics. В статье отмечены и наши собственные данные об использовании производного гидрокортизона RX624 (PubChem CID: 3643) в качестве терапевтического агента для блокирования вторичных повреждений после ЧМТ. Важно отметить, что на это соединение нами была подана заявка на регистрацию патента в Федеральную службу по интеллектуальной собственности. В данный момент заявка находится на стадии экспертизы. Мы начали выполнять основной блок работ, касающийся сочетанной терапии пост-травматического состояния с помощью химических препаратов, блокирующих агрегацию ГАФД и активирующих синтез Hsp70. Так, мы апробировали комбинированную терапию на крысах, получивших ЧМТ. В течение 30 дней продолжающейся терапии регистрировали спонтанную двигательную активность животных, а по окончанию терапии были поставлен ряд поведенческих тестов для оценки двигательной функции и функции памяти. Данные, полученные в результате поведенческих тестов на животных, в данный момент обрабатываются. Для дальнейшего анализа собраны биоматериалы подопытных животных (спинномозговая жидкость, головной мозг). К настоящему моменту по тематике проекта опубликовано 3 статьи, 2 из которых в журналах первого квартиля, и еще 1 статья принята к публикации.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Черепно-мозговая травма (ЧМТ) остаётся значимой проблемой современной медицины: ежегодно по всему миру количество пострадавших от ЧМТ составляет около 10 млн. человек в год причем до 40% случаев имеют летальный исход, а среди выживших приблизительно у 60% наблюдается ухудшение состояния после госпитализации. Учитывая, что пострадавшим оказывают максимально возможную экстренную медицинскую помощь по устранению первичных повреждений, причиной осложнений являются вторичные последствия ЧМТ, появляющиеся через часы и дни после травмы. Механизмы вторичных до сих пор не до конца изучены и, предположительно, могут довольно сильно отличаться в зависимости от типа травм, что является одной из причин низкой эффективности лекарств, применяемых в настоящее время. Поэтому поиск новых мишеней, лекарств и терапевтических подходов для терапии пост-травматического состояния является актуальным вопросам нейробиологии. В защите клеток от патогенных факторов важную роль играет белок теплового шока Hsp70, который участвует в блокировании разнообразных путей апоптоза, и, что важно, является ключевым элементом клеточной системы распознавания и деградации белков с нарушенной конформацией. Другой потенциальной мишенью для терапевтического вмешательства при ЧМТ являются белки, повреждение которых приводит к их олигомеризации и агрегации, вызывая в результате массовую клеточную гибель. Один из таких белков, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа (ГАФД), в результате окислительного стресса может формировать цитотоксические агрегаты. Третий год работы над проектом в первую очередь был посвящен комбинированной терапии пост-травматического состояния с помощью химических препаратов, блокирующих агрегацию ГАФД и активирующих синтез Hsp70. В качестве ингибитора агрегации ГАФД мы использовали производное гидрокортизона RX624, уже продемонстрировавшее эффективность в предотвращении развития вторичных повреждений после ЧМТ. Для индукции синтеза шаперонов мы использовали производное пирролилхиноксалина PQ-29, для которого ранее также был показан терапевтический потенциал на модели ЧМТ на крысах. В течение 1 месяца после ЧМТ крысам трижды в неделю внутрибрюшинно вводили соединения RX624 и PQ-29. По окончанию терапии были поставлены водный тест Морриса (для оценки функции памяти) и тест сужающаяся дорожка (для анализа двигательной функции). Кроме того, оценивали уровень агрегации ГАФД в гиппокампах животных. В ряде экспериментов мы наблюдали некоторое преимущество комбинированной терапии над монотерапией. Но в целом, следует признать, что для использования в клинике требуются более эффективные препараты и/или терапевтическая стратегия. В планах коллектива осуществить поиск более эффективных индукторов синтеза шаперонов и апробировать комбинированную терапию с помощью антиоксидантов и индукторов синтеза шаперонов. Значимым этапом работы над проектом стал поиск конкретной мишени для действия пирролилазинов в клетке. В нашей лаборатории были найдены химические соединения из коллекции Уральского федерального университета, относящиеся к пирролил- и индолилазинам. Таким образом мы сконцентрировали внимание на 4 соединениях: PQ-29, EA-3, TM-378 и KD-47. Еще в течение второго года работы над проектом мы подготовили список белков, связывание пирролилазинов с которыми, может приводить к активации синтеза белков теплового шока. Мы провели молекулярный докинг некоторых производных пирролил- и индоллилазинов и установили, что потенциальной мишенью их действия может быть казеин киназа 2. Таким образом, обозначив изначально белки теплового шока в качестве одной из мишеней для терапии вторичных повреждений после ЧМТ, мы не только предложили новые соединения для индукции синтеза шаперонов, но и предположили механизм действия индукторов. Так, мы предполагаем, что использование некоторых пирролилазинов приводит к блокированию активности казеин киназы, которая обеспечивает ингибиторное фосфорилирование Heat Shock Factor 1 (HSF1). Соответственно, блокирование казеин киназы приводит к активации HSF1 и индукции экспрессии генов белков теплового шока, накопление которых в нейронах повышает жизнеспособность последних. Наконец, мы осуществили расчет in silico параметров абсорбции, распределения, метаболизма и выведения пирролил- и индоллилазинов. Основной вывод из этой части работы заключается в том, что все выбранные нами соединения соответствуют критериям Липински для лекарственных препаратов. Общий и наиболее значимый недостаток использованных индукторов синтеза шаперонов – крайне низкая растворимость в воде. За третий год работы над проектом было опубликовано либо принято к публикации 2 статьи, в том числе 1 статья в журнале первого квартиля. Кроме того, получено решение Федерального института промышленной собственности о выдаче патента на нейропротекторную активность соединения RX624 – ингибитора агрегации белка ГАФД.