КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 19-13-00231

НазваниеСинтез конъюгатов пурина и его аналогов, потенциальных противовирусных и антибактериальных средств

РуководительКраснов Виктор Павлович, Доктор химических наук

Организация финансирования, регионФедеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт органического синтеза им. И.Я.Постовского Уральского отделения Российской академии наук, Свердловская обл

Годы выполнения при поддержке РНФ 2019 - 2021  , продлен на 2022 - 2023. Карточка проекта продления (ссылка)

КонкурсКонкурс 2019 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 03 - Химия и науки о материалах, 03-103 - Синтез, строение и свойства природных и физиологически активных веществ; медицинская химия и прогнозирование различных видов биоактивности

Ключевые словапурины, пиримидины, аминокислоты, N-гетероциклы, энантиомеры, нуклеофильное замещение, конденсация, высоко-эффективная жидкостная хроматография, ЯМР спектроскопия, противовирусная активность, антибактериальная активность

Код ГРНТИ31.21.00


СтатусУспешно завершен


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
Настоящий проект направлен на решение научной проблемы разработки рациональных методов синтеза новых производных пурина и структурно родственных соединений с целью создания эффективных антибактериальных и противовирусных средств и выявления связей «структура–активность» в ряду синтезированных соединений. В настоящее время для терапии вирусных и ряда других заболеваний широко применяются лекарственные средства на основе производных пурина. Актуальность поиска новых соединений, обладающих высокой противомикробной (в частности туберкулостатической) и противовирусной активностью не вызывает сомнений. Эта задача становится все более актуальной, поскольку основной проблемой лечения многих заболеваний является возникновение лекарственной устойчивости к действию препаратов, применяемых в настоящее время. В связи с этим, по-прежнему актуальным является дизайн новых конъюгатов пурина и его аналогов с аминокислотами, гетероциклическими и другими соединениями, разработка эффективных методов их синтеза, изучение биологической активности и возможного механизма биологического действия. Предлагаемое исследование основано на результатах проекта РНФ 14-13-01077 «Синтез новых биологически активных соединений путем модификации пуриновых оснований аминокислотами, пептидами и хиральными аминами» (2014-2016; продление 2017-2018), в ходе выполнения которого удалось показать перспективность исследований в указанном направлении, впервые обнаружить у соединений указанной группы высокую противотуберкулезную и противовирусную активность, в том числе в отношении штаммов, устойчивых к действию известных препаратов, и выявить соединения-лидеры. Одно из соединений проходит в настоящее время доклинические исследования в рамках ФЦП «ФАРМА-2020». В рамках настоящего Проекта предполагается решить ряд новых задач, направленных на совершенствование методов синтеза конъюгатов пурина, 2-аминопурина и их структурных аналогов (в частности, пиримидинов), синтезировать широкий круг новых производных, содержащих фрагменты аминокислот, коротких пептидов, N-гетероциклов и аминов различного строения, и провести тестирование их биологической активности. Подходы и научные решения, которые планируется реализовать в рамках выполнения проекта, будут служить весомым вкладом не только в химию производных пурина, но и в целом в химию гетероциклических соединений; а среди синтезированных соединений могут быть обнаружены соединения-кандидаты для терапии вирусных, бактериальных и других заболеваний. Научная новизна планируемого исследования заключается в том, что будут разработаны методы получения новых производных пурина, 2-аминопурина и их структурных аналогов (в частности, пиримидинов), замещенных в разных положениях фрагментами аминокислот, коротких пептидов, N-гетероциклов и аминов различного строения. В связи с тем, что биологическая активность хиральных соединений во многих случаях зависит от стереоконфигурации, особое внимание планируется уделить разработке методов синтеза энантиомерно чистых производных и анализу их оптической чистоты. В работе будет реализован ряд синтетических подходов к получению новых конъюгатов пурина: нуклеофильное замещение хлора в 6-хлорпуринах и хлорпиримидинах; введение пуринового фрагмента в структуру омега-аминокислот различной длины; а также особое внимание планируется уделить изучению причин рацемизации в процессе синтеза хиральных производных. Предполагается провести тестирование противовирусной и противотуберкулезной активности полученных соединений в экспериментах in vitro и in vivo с целью определения закономерностей структура-активность в ряду синтезированных соединений. Запланированные в настоящем проекте результаты являются достижимыми, поскольку у авторов проекта имеется научный задел по указанной теме, опыт работы с указанными объектами, необходимая квалификация и научное оборудование.

Ожидаемые результаты
Ожидается, что в результате выполнения проекта будут разработаны методы синтеза новых производных пурина и пиримидина, модифицированных остатками оптически чистых аминокислот, коротких пептидов, азотсодержащих гетероциклов и аминов различного строения. Будут предложены различные пути получения 6-замещенных конъюгатов пурина и 2-аминопурина (в том числе путь, предусматривающий использование линкерных фрагментов различной длины). Планируется разработать методы анализа стереоизомерного состава конъюгатов пурина, содержащих фрагменты хиральных соединений. Ожидается, что среди синтезированных соединений будут найдены высокоактивные соединения для создания на их основе новых лекарственных препаратов для терапии вирусных инфекций, туберкулеза и др. заболеваний. Предполагается, что научные результаты, полученные в ходе выполнения проекта, будут опубликованы в международных научных изданиях, в том числе в журналах, входящих в первый квартиль (Q1) по импакт-фактору JCR Science Edition, и послужат значимым вкладом в химию гетероциклических соединений и физиологически активных веществ.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2019 году
В 2019 г. в рамках выполнения проекта с целью разработки методов синтеза конъюгатов N-(2-аминопурин-6-ил)глицина и N-(пурин-6-ил)глицина с аминобензойными кислотами изучены различные синтетические подходы к целевым соединениям. В результате проведенных исследований разработаны методы синтеза конъюгатов N-(2-аминопурин-6-ил)глицина и N-(пурин-6-ил)глицина с 5-амино-1,3-бензолдикарбоновой и 4-амино-2-фторбензойной кислотами; исследованы разнообразные подходы к синтезу конъюгатов N-(2-аминопурин-6-ил)глицина и N-(пурин-6-ил)глицина с 2-амино-1,4-бензолдикарбоновой кислотой. В отчетный период, продолжая исследования влияния аминокислоты-линкера на антимикобактериальную активность конъюгатов пурина с глутаминовой кислотой, в дополнение к запланированному синтезированы конъюгаты пурина с (S)-серином и дипептидом (S)-серил-(S)-глутаминовая кислота. Разработаны методы синтеза конъюгатов пурина и 2-аминопурина с сульфокислотами: таурином и сульфаниловой кислотой; изучена возможность синтеза конъюгатов пурина и 2-аминопурина с аминометансульфокислотой. Проведен большой комплекс экспериментов по изучению возможности синтеза целевых соединений с использованием альтернативных подходов и предложены пути решения поставленных задач. Изучена возможность введения остатка глутаминовой кислоты в структуру пуринового ядра путем алкилирования 6-меркаптопурина диметиловым эфиром N-фталоил-4-бромглутаминовой кислоты. Показано, что реакция алкилирования 6-меркаптопурина 4-бромпроизводным глутаминовой кислоты проходит с хорошим выходом. Разработаны методы ВЭЖХ анализа стереоизомерной чистоты синтезированного соединения. На следующем этапе будет продолжено изучение возможности удаления защитных групп. Разработаны методы синтеза конъюгатов 7-деазапурина с глицил-(S)-глутаминовой кислотой, а также с аланил-(S)-глутаминовой кислотой путем конденсации N-(7-деазапурин-6-ил) аминокислот с диметиловым эфиром (S)-глутаминовой кислоты в присутствии конденсирующего агента (DCC). Показано, что в этих условиях конденсация N-(7-деазапурин-6-ил)-(S)-аланина сопровождается рацемизацией хирального центра (S)-аланина. Для синтеза диастереомерно чистой N-(7-деазапурин-6-ил)-(S)-аланил-(S)-глутаминовой кислоты предложен альтернативный поход, заключающийся в предварительном получении дипептида (S)-аланин-(S)-глутаминовая кислота, который использовали в качестве нуклеофила в реакции замещения хлора в 7-деаза-6-хлорпурине. Разработаны методы ВЭЖХ анализа стереоизомерной чистоты синтезированных соединений. Разработаны методы синтеза омега-аминоалкановых кислот H2N(CH2)nCOOH (n = 8 и 14); изучена возможность синтеза 10-аминодекановой кислоты (n = 9) исходя из 9-аминононановой кислоты. Омега-аминоалкановые кислоты (n = 8 и 14) наработаны в количествах, достаточных для дальнейшего синтеза соответствующих производных. Используя разрабатываемый нами метод кинетического разделения рацемических аминов в результате ацилирования хлорангидридами хиральных кислот, наработаны индивидуальные (S)- и (R)-энантиомеры 3,4-дигидро-3-метил-7,8-дифтор-2H-[1,4]бензоксазина, необходимые для получения конъюгатов пурина с линкерами различной длины. Используя разработанную нами синтетическую последовательность получены конъюгаты пурина с N-(омега-аминоалканоил)-производными 3,4-дигидро-3-метил-7,8-дифтор-2H-[1,4]бензоксазина (n = 6, 10, 11). Для сравнительного изучения антивирусной активности синтезированы (S)- и (R)-энантиомеры 3,4-дигидро-3-метил-4-[8-(пурин-6-ил)аминооктаноил]-7,8-дифтор-2H-[1,4]бензоксазина, а также 3,4-дигидро-4-[6-(пурин-6-ил)аминогексаноил]-2H-[1,4]бензотиазин. Разработаны методы определения энантиомерного состава синтезированных соединений. Разработаны методы синтеза конъюгатов 7-деазапурина и 2-фторпурина, а также 2-хлорпурина, содержащих фрагмент N-(6-аминогексаноил)-3,4-дигидро-3-метил-7,8-дифтор-2H-[1,4]бензоксазина; разработаны методы ВЭЖХ анализа энантиомерной чистоты синтезированных соединений. Все новые соединения охарактеризованы комплексом физико-химических методов (1H, 13C и 19F ЯМР спектроскопия, элементный анализ, хромато-масс-спектрометрия высокого разрешения, ВЭЖХ, поляриметрия). В отчетный период проводилось тестирование противотуберкулезной и противовирусной активности полученных соединений в опытах in vitro. В Уральский НИИ фтизиопульмонологии (Екатеринбург) для изучения специфической туберкулостатической активности передано 13 конъюгатов пурина и 2-аминопурина, синтезированных в рамках выполнения проекта в 2019 г. Часть соединений протестирована методом вертикальной диффузии с использованием лабораторного штамма Mycobacterium tuberculosis H37Rv на плотной питательной среде «Новая». Установлено, что конъюгаты пуринов с сульфаниловой кислотой не проявляют антимикобактериальную активность, а конъюгат 7-деазапурина с дипептидом аланил-(S)-глутаминовая кислота проявляет умеренную туберкулостатическую активность (МИК 6,2 мкг/мл). В настоящее время тестирование туберкулостатической активности in vitro еще десяти соединений, синтезированных в 2019 г., проводится REMA-методом. Совместно с Уфимским институтом химии УФИЦ РАН начаты работы по молекулярному моделированию синтезированных соединений в активный центр глутаминсинтазы Mycobacterium tuberculosis. В 2019 г. начаты исследования противовирусной активности новых соединений. Протестировано 9 соединений в отношении вируса герпеса простого тип 1 (ВПГ-1) на эталонном штамме L2 вируса герпеса (ВПГ-1/L2) и штамме ВПГ-1/L2/R, глубоко резистентном к ацикловиру. Установлено, что некоторые из испытанных соединений обладают способностью селективно ингибировать репродукцию вируса герпеса простого тип 1 при использовании в нецитотоксических концентрациях в культуре клеток Vero E6, причем эти соединения одинаково эффективны на обеих вирусных моделях и обладают противовирусной активностью, превышающей активность препарата сравнения – фосфоноформата, являющегося в клинической практике препаратом выбора в случае неэффективности ацикловира и родственных соединений, включая случаи развития лекарственной резистентности, что дает основания считать перспективным дальнейшее исследование соединений указанной группы и их аналогов. По материалам исследования в 2019 г. опубликовано три статьи в журналах, индексируемых в базах данных Web of Science Core Collection, Scopus и РИНЦ: две статьи в Журнале органической химии (импакт-фактор 0,751) и одна статья в European Journal of Organic Chemistry (импакт-фактор 3,029), входящем в первый квартиль Q1. Результаты работ по проекту были представлены на 3-х российских (с международным участием) и международных конференциях в виде четырех стендовых сообщений, двух устных докладов и одного приглашенного доклада.

 

Публикации

1. Краснов В.П., Вигоров А.Ю., Чулаков Е.Н., Низова И.А., Левит Г.Л., Кравченко М.А., Чарушин В.Н. Synthesis of Purine and 2-Aminopurine Conjugates with N-(4-Aminobenzoyl)-(S)-glutamic acid RUSSIAN JOURNAL OF ORGANIC CHEMISTRY, Vol. 55, No. 6, pp. 755–761 (год публикации - 2019).

2. Краснов В.П., Мусияк В.В., Воздвиженская О.А., Галегов Г.А., Андронова В.Л., Груздев Д.А., Чулаков Е.Н., Вигоров А.Ю., Ежикова М.А., Кодесс М.И., Левит Г.Л., Чарушин В.Н. N-[omega-(Purin-6-yl)aminoalkanoyl] Derivatives of Chiral Heterocyclic Amines as Promising Anti-Herpesvirus Agents EUROPEAN JOURNAL OF ORGANIC CHEMISTRY, Iss. 30, pp. 4811-4821 (год публикации - 2019).

3. Мусияк В.В., Низова И.А., Матвеева Т.В., Левит Г.Л., Краснов В.П. Чарушин В.Н. Synthesis of New Purine Derivatives Containing α- and ω-Amino Acid Fragments RUSSIAN JOURNAL OF ORGANIC CHEMISTRY, Vol. 55, No. 6, pp. 762–770 (год публикации - 2019).


Аннотация результатов, полученных в 2020 году
В 2020 г. исследованы разнообразные подходы к синтезу конъюгатов N-(2-аминопурин-6-ил)глицина и N-(пурин-6-ил)глицина с гамма-аминомасляной кислотой и 5-гидрокси-L-норвалином. Метод нуклеофильного замещения хлора в 6-хлорпуринах дипептидом глицил-гамма-аминомасляная кислота выбран в качестве оптимального метода синтеза конъюгатов пуринилглицина с гамма-аминомасляной кислотой. Получение конъюгатов пуринилглицина с 5-гидрокси-L-норвалином предложено проводить исходя из -трет-бутилового -метилового эфира глутаминовой кислоты по реакции конденсации с пуринилглицином с последующим восстановлением гамма-сложноэфирной группы. Изучена возможность синтеза конъюгатов пурина и 2-аминопурина с глутаминовой кислотой, содержащих фрагмент аминосульфокислоты (таурина, 4-аминобензолсульфокислоты) в качестве линкера. Для получения конъюгатов пурина и глутаминовой кислоты, соединенных 4-аминобензолсульфонильным фрагментом, синтезирована N-(4-нитробензолсульфонил)-(S)-глутаминовая кислота, последующее гидрирование нитрогруппы и нуклеофильное замещение хлора в 6-хлорпуринах N-(4-аминобензолсульфонил)-(S)-глутаминовой кислотой приводит к целевым соединениям. Нуклеофильное замещение хлора в 6-хлорпурине ди-трет-бутиловым эфиром N-(2-аминоэтансульфонил)-(S)-глутаминовой кислоты и последующее удаление сложноэфирных групп приводило к конъюгату пурина и глутаминовой кислоты, соединенных фрагментом таурина. Исследованы различные синтетические подходы к конъюгатам пиримидинов с глицил-(S)-глутаминовой кислотой; особое внимание было уделено оценке энантиомерной чистоты синтезированных соединений. Оптимальный метод синтеза целевых соединений с хорошими выходами основан на нуклеофильном замещения хлора в хлорпиримидинах дипептидом Gly-(S)-Glu при кипячении реагентов в водном растворе Na2CO3. Разработан метод ВЭЖХ анализа хиральной неподвижной фазе энантиомерного состава синтезированных продуктов. Установлено, что предложенный синтетический подход, основанный на проведении реакции в достаточно жестких условиях (кипячение при pH 9-10), не приводит к рацемизации хирального центра фрагмента глутаминовой кислоты и позволяет получать энантиомерно чистые целевые соединения. Разработанный в отчетный период подход использован также для синтеза конъюгата 7-деазапурина с глицил-(S)-глутаминовой кислотой с выходом 32%. Разработаны методы синтеза конъюгатов пурина, содержащих фрагмент 3,4-дигидро-3-метил-7,8-дифтор-2H-[1,4]бензоксазина (как рацемического, так и энантиочистого), присоединенный через остатки омега-аминоалкановых кислот с различной длиной метиленовой цепи (n = 8, 9, 14) и методы анализа стереоизомерной чистоты синтезированных конъюгатов. Целевые соединения получены исходя из соответствующих хлорангидридов N-фталимидо-омега-алкановых кислот, которые использовали для ацилирования 3,4-дигидро-3-метил-7,8-дифтор-2H-[1,4]бензоксазина. Последующий гидразинолиз и нуклеофильное замещение хлора в 6-хлорпурине приводили к конъюгатам пурина и 3,4-дигидро-3-метил-7,8-дифтор-2H-[1,4]бензоксазина, соединенным линкерами различной длины, с хорошими выходами (44-66%). Целевые соединения были наработаны в количествах, достаточных для тестирования их противовирусной активности. На примере конъюгата пурина с 3,4-дигидро-3-метил-7,8-дифтор-2H-[1,4]бензоксазином, содержащего фрагмент 15-аминопентадекановой кислоты, разработана методика ВЭЖХ анализа энантиомерного состава, и подтверждено отсутствие рацемизации в ходе получения конъюгатов пурина с хиральными гетероциклическими аминами с использованием предложенной нами синтетической стратегии. Разработаны методы синтеза конъюгатов пурина, содержащих фрагменты различных N-гетероциклов (морфолина, тиоморфолина, пиперидина, 2- и 3-метилпиперидинов, 2-метилпирролидина, 2-метил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолина, 5-фториндолина), присоединенных через остаток 6-аминогексановой кислоты. Синтез целевых соединений осуществляли путем конденсации 6-(пурин-6-ил)аминогексановой кислоты с соответствующими гетероциклическими аминами карбодиимидным методом. Выходы целевых соединений составляли 54-77% после хроматографической очистки или перекристаллизации. Получение конъюгатов пурина с менее основными аминами (дигидро-2H-[1,4]бензотиазином и 10,11-дигидро-5H-дибензо[b,f]-азепином) проведено с использованием альтернативного метода, заключающегося в предварительном получении амидов 6-аминогексановой кислоты и последующем нуклеофильном замещении хлора в 6-хлорпурине. В 2020 г. разработаны рациональные подходы к синтезу производных пиримидинов, содержащих фрагмент 3,4-дигидро-3-метил-7,8-дифтор-2H-[1,4]бензоксазина, присоединенный через остаток 6-аминогексановой кислоты. Найдены условия ВЭЖХ разделения (R)- и (S)-энантиомеров на хиральной неподвижной фазе. Было показано, что энантиомерная чистота (ee) (S)-энантиомера составляет >99%, что свидетельствует об отсутствии рацемизации хирального центра в ходе синтеза. Таким же образом были синтезированы хлорсодержащие конъюгаты пиримидина с (RS)-4-(6-аминогексаноил)-3,4-дигидро-3-метил-7,8-дифтор-2H-[1,4]бензоксазином (выход 68%). Используя этот подход, мы получили также (S)-энантиомер конъюгата 4-(6-аминогексаноил)-3,4-дигидро-3-метил-7,8-дифтор-2H-[1,4]бензоксазина с 7-деазапурином с выходом 29%. ВЭЖХ анализ на хиральной неподвижной фазе также показал энантиомерную чистоту полученного соединения. Все новые соединения охарактеризованы комплексом физико-химических методов (1H, 13C и 19F ЯМР спектроскопия, элементный анализ, хромато-масс-спектрометрия высокого разрешения, ВЭЖХ, поляриметрия). В отчетный период проведено тестирование противотуберкулезной и противовирусной активности ряда полученных соединений в опытах in vitro. В Уральском НИИ фтизиопульмонологии (Екатеринбург) проведено изучение специфической туберкулостатической активности 14 конъюгатов пурина и 2-аминопурина, синтезированных в рамках выполнения проекта в 2019-2020 гг. Тестирование туберкулостатической активности проведено с использованием REMA-метода, препарат сравнения - изониазид. Проведенные исследования показали, что изученные соединения, в отличие от соединения-лидера (N-(2-аминопурин-6-ил)глицил-(S)-глутаминовой кислоты) не подавляют рост микобактерий туберкулеза даже в высокой концентрации 50 мг/л, т.е. не обладают туберкулостатической активностью. Изучение противовирусной активности конъюгатов пурина и N-гетероциклов, соединенных фрагментами омега-аминоалкановых кислот, в отношении эталонного штамма вируса герпеса простого типа 1 (ВПГ-1/L2) и штамма ВПГ-1/L2/R, глубоко резистентного к ацикловиру, проведено в Институте вирусологии им. Д.И. Ивановского ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» МЗ РФ (Москва). В качестве препаратов сравнения использовали ацикловир и фоскарнет (гексагидрат фосфоноформиата натрия) - препарат выбора в клинической практике в случае неэффективности ацикловира и родственных соединений, включая случаи развития лекарственной резистентности. Для оценки цитотоксичности исследуемых соединений процент жизнеспособных клеток определяли методом окрашивания трипановым синим. Среди новых соединений наибольшей активностью и избирательностью (химиотерапевтический индекс SI = 19) обладает конъюгат пурина и 3-метилдифторбензоксазина, содержащий остаток 9-аминононановой кислоты. Сравнимым с ним по активности является соединение, содержащее в качестве линкера фрагмент 11-аминоундекановой кислоты (ID50 = 4.64 µМ); однако, оно обладает высокой цитотоксичностью (CD50 = 21.54 µМ) и соответственно меньшей селективностью (SI = 5). Соединение с максимальной длиной линкера в изученном ряду (n = 14) также проявляет высокую противогерпетическую активность (ID50 = 7.14 µМ). В 2020 г. с целью установления этапа жизненного цикла ВПГ, на который направлено действие (S)-энантиомера 3,4-дигидро-3-метил-4-[6-(пурин-6-ил)аминогексаноил]-7,8-дифтор-2H-[1,4]бензоксазина, высокоселективного ингибитора репродукции ВПГ-1 (SI = 63), проведено комплексное исследование in vitro, включающее построение ростовой кривой вируса, изучение зависимости выраженности антивирусной активности изучаемого соединения от времени введения препарата в экспериментальную систему (метод варьирования времени добавления препарата; time-of-addition assay (TАA)). Впервые было показано, что исследуемое соединение сохраняет выраженное противовирусное действие при внесении в экспериментальную систему не позднее 9 ч после инфицирования (pi), но не влияет на выход ВПГ-1 из клетки. Полученные результаты, а также известные данные о том, что в клеточной культуре, инфицированной ВПГ с высокой множественностью (≥ 1 БОЕ/кл), синтез вирусной ДНК прекращается через 9-12 ч после адсорбции, в совокупности позволяют предположить, что соединение вмешивается в жизненный цикл ВПГ-1 во время синтеза вирусной ДНК. В Санкт-Петербургском НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера проведено изучение противовирусной активности конъюгатов пурина и различных N-гетероциклов, соединенных фрагментами 6-аминогексановой кислоты и других омега-аминоалкановых кислот, в отношении эталонного штамма вируса гриппа A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) и B/Florida/4/2006 при помощи теста на подавление вирус-индуцированного цитопатического действия (ЦПД) в культуре клеток MDCK. В качестве препарата сравнения использовали осельтамивир (в форме осельтамивира карбоксилата) - препарат, применяемый в клинике для лечения гриппа. Жизнеспособность инфицированных и здоровых клеток оценивали с помощью метилтетразолиевого теста. Изученные конъюгаты пурина отличались умеренной активностью в отношении вируса гриппа A; величина индекса селективности SI не превышала 15; (S)-энантиомер N-(пурин-6-ил)глицил производного 3,4-дигидро-3-метил-7,8-дифтор-2H-[1,4]бензоксазина оказался заметно активнее рацемата (SI = 6). Среди (пурин-6-ил)аминогексаноил производных других N-гетероциклов наибольшей противогриппозной активностью отличались производные тиоморфолина (SI = 8), 2-метилпирролидина (SI = 10) и бензотиазина (SI = 11). Установлено, что токсичность изученных соединений нарастает с увеличением длины алифатического линкера. Противовирусная активность соединений напротив, снижалась, что выражалось в повышении величины IC50 и уменьшении значений индекса селективности. Оптимальными характеристиками (низкая токсичность и относительно высокая селективность) обладали конъюгаты пурина с 3-метилдифторбензоксазином. Структура гетероциклического фрагмента оказывала решающее влияние на показатели биологической активности изученных конъюгатов пурина. Оптимальными характеристиками обладали конъюгаты пурина с 2-метилпирролидином и бензотиазином. При этом цитотоксичность пуринового производного, содержащего фрагмент бензотиазина, была на порядок выше по сравнению с цитотоксичностью соединения, несущего в том же положении 2-метилпирролидин. Максимальную цитотоксичность проявляли соединения со свободным или аннелированным метилпиперидиновым заместителем, а также производное, содержащее фрагмент дибензо[b,f]азепина. Полученные результаты дают основания считать перспективным дальнейшее исследование соединений указанной группы и их аналогов в качестве противовирусных агентов. В 2020 г. было продолжено исследование глутамин-синтетазы микобактерий (Mycobacterium tuberculosis glutamine synthetase, MtGS) в качестве потенциальной мишени действия ранее синтезированных конъюгатов пурина. Молекулярный докинг синтезированных производных пурина в активный центр MtGS показал, что соединения, проявившие существенную антимикобактериальную активность в опытах in vitro, отличаются высокими показателями уровня воспроизводимости укладки, кластеризуемости решений докинга и аффинности, что указывает на высокую потенциальную мишень-специфичность. Наибольшей активностью в опытах in vitro отличались пуринсодержащие дипептиды на основе (S)-глутаминовой кислоты. N-(Пурин-6-ил)глицил-производные других аминокислот обладали более низким сродством к мишени, что отражается не только низкими показателями скоринг-функции, но и низкой кластеризуемостью решений докинга. Установлено, что связывание молекул пуринил-производных аминокислот в активном центре MtGS обеспечивается взаимодействием с фрагментами ионизируемых аминокислот (Lys361, Glu214, Arg364), а также ароматическими взаимодействиями с остатками Trp282, Tyr129 и Phe232. Картирование сайта связывания MtGS показало, что наиболее подходящий лиганд должен содержать от 34 до 45 атомов, включать гидрофобный заместитель при пуриновом ядре, а также группы с неподеленными электронными парами или другие электронодонорные фрагменты, что должно учитываться при планировании синтеза новых конъюгатов. По материалам исследования в 2020 г. опубликовано две статьи в изданиях, индексируемых в базах данных «Сеть науки» (Web of Science Core Collection) или «Скопус» (Scopus): Pure and Applied Chemistry (импакт-фактор 1,919, Q2) и ChemistrySelect (импакт-фактор 1,811, Q2). Одна статья принята в печать в журнале Вопросы вирусологии, который индексируется базах данных «Скопус» (Scopus) и РИНЦ. Кроме того, две статьи подготовлены и направлены для публикации в специальный выпуск «Гетероциклы против вирусов» журнала Химия гетероциклических соединений. Результаты работ по проекту были представлены на 4-х российских и международных конференциях в виде двух стендовых сообщений, двух устных и четырех приглашенных докладов.

 

Публикации

1. Андронова В.Л., Галегов Г.А., Мусияк В.В., Воздвиженская О.А., Левит Г.Л., Краснов В.П. Антивирусный эффект нового коньюгата пурина LAS-131 в отношении вируса простого герпеса первого типа in vitro Вопросы вирусологии, - (год публикации - 2020).

2. Вакаров С.А., Чулаков Е.Н., Садретдинова Л.Ш., Кодесс М.И., Ежикова М.А., Первова М.Г., Ганебных И.Н., Левит Г.Л., Краснов В.П. Kinetic Resolution of Racemic 2-Aryloxy Propionyl Chlorides Using Enantiopure (S)-3,4-Dihydro-3-methyl-2H-[1,4]benzoxazines ChemistrySelect, Том: 5 Выпуск: 13 Стр.: 4069-4073 (год публикации - 2020).

3. Краснов В.П., Левит Г.Л., Мусияк В.В., Груздев Д.А., Чарушин В.Н. Fragment-based approach to novel bioactive purine derivatives Pure and Applied Chemistry, Том: 92 Выпуск: 8 Стр.: 1277-1295 (год публикации - 2020).


Аннотация результатов, полученных в 2021 году
В отчетный период были продолжены работы по синтезу конъюгатов пурина, 2-аминопурина и пиримидина, связанных с фрагментом (S)-глутаминовой кислоты (или родственных соединений) линкером, представляющим собой разнообразные по природе аминокислоты, с целью получения аналогов соединения-лидера – (2-аминопурин-6-ил)глицил-(S)-глутаминовой кислоты, обладающей туберкулостатической активностью. Завершены начатые на предыдущем этапе работы по синтезу конъюгата N-(пурин-6-ил)глицина с 5-гидрокси-L-норвалином. В отчетный период разработан оригинальный метод синтеза оптически чистого (S)-5-гидроксинорвалина исходя из альфа-трет-бутилового гамма-метилового эфира (S)-глутаминовой кислоты. Целевой конъюгат удалось получить с выходом 22% в результате нуклеофильного замещения хлора в 6-хлорпурине дипептидом глицин–5-гидроксинорвалин с последующей очисткой методом колоночной флеш-хроматографии. В 2021 г. завершены начатые в предыдущий период работы по синтезу конъюгатов пурина и глутаминовой кислоты, соединенных 4-амино-бензолсульфонильным фрагментом. Гидрирование нитрогруппы N-(4-нитробензолсульфонил)-(S)-глутаминовой кислоты давало соответствующее аминопроизводное. Нуклеофильное замещение хлора в 6-хлорпурине и 2-амино-6-хлорпурине под действием этого соединения приводило к целевым N-(пурин-6-ил)- и N-(2-аминопурин-6-ил)-4-аминобензолсульфонил-(S)-глутаминовым кислотам соответственно с высокими выходами. В дополнение к запланированным исследованиям, синтезированы конъюгаты пурина с производными 4-аминопироглутаминовой кислоты. Синтез целевых коньюгатов проводили по схеме, включающей синтез защищенных дипептидов, удаление защитных групп и нуклеофильное замещение хлора в 6-хлорпурине с получением целевых продуктов. При удалении сложноэфирной группы дипептидов в 1 M NaOH при комнатной температуре происходит частичная рацемизация остатка пироглутаминовой кислоты по атому С(4). Полученную смесь диастереомерных дипептидов использовали для нуклеофильного замещения хлора в 6-хлорпурине при кипячении в воде в присутствии Na2CO3. Целевые индивидуальные (2S,4S)-изомеры выделены из реакционной массы методом дробного осаждения из щелочного раствора соляной кислотой. В процессе осаждения происходило энантиомерное обогащение целевых соединений. В отчетный период были разработаны методы синтеза хлорпиримидинов, содержащих дипептид глицил-(S)-глутаминовая кислота и методы оценки энантиомерной чистоты синтезированных соединений. Нуклеофильное замещение хлора в 4,6-дихлорпиримидинах дипептидом Gly–(S)-Glu проводили при кипячении реагентов в водном растворе соды с последующим подкислением реакционной смеси. Целевые конъюгаты получены с выходами 30-39% в количествах, достаточных для передачи на изучение антимикобактериальной активности. Использованный синтетический подход не приводит к рацемизации хирального центра (S)-глутаминовой кислоты и позволяет получить целевые конъюгаты в энантиомерно чистом виде. В отчетный период разработаны методы синтеза конъюгатов пурина, содержащих фрагменты адамантиламинов и аминокарборана. Для синтеза конъюгатов пурина с адамантиламинами различного строения (1-аминоадамантаном, 2 аминоадамантаном и римантадином), содержащих в качестве линкера фрагмент 6-аминогексановой кислоты, разработано два подхода. Первый подход заключается в конденсации первичных аминоадамантанов с пуринилгексановой кислотой в присутствии конденсирующего агента. Целевые соединения были получены с хорошими выходами 55-65%. Второй подход предусматривает предварительное получение амидов 6-фталоилгексановой кислоты и аминоадамантанов. Последующий гидразинолиз для удаления N-фталоильной защитной группы приводит к образованию соответствующих первичных аминов, которые вводили в реакцию нуклеофильного замещения хлора в 6-хлорпурине. Общий выход целевых конъюгатов в этом методе составляет 40-52%. В 2021 г. проведен подробный анализ литературных данных о синтезе, свойствах и применении карборансодержащих аминокислот [Gruzdev D.A., Levit G.L., Krasnov V.P., Charushin V.N. Coord. Chem. Rev. 2021, 433, 213753] и продемонстрирован возросший в последнее время интерес к противовирусным свойствам производных карборана. В связи с этим в отчетный период мы разработали методы получения производных пурина и 2-аминопурина, содержащих остатки 7,8-дикарба-нидо-ундекаборана (нидо-карборана). Для этого были синтезированы нидо-карборансодержащие строительные блоки - (нидо-карборан-7-ил)ацетил-производное этилендиамина в виде цвиттер-иона и 3-(6-аммониогексаноиламино)-нидо-карборан. Проведено нуклеофильное замещение хлора в 6-хлорпурине и 2-амино-6-хлорпурине под действием полученных нидо-карборанов в качестве нуклеофилов. Изучены различные условия реакции и выбраны оптимальные условия синтеза целевых конъюгатов пурина и 2-аминопурина. Таким образом, нами впервые получены конъюгаты пурина с каркасными соединениями, такими как адамантиламины и нидо-карбораны. Все новые соединения охарактеризованы комплексом физико-химических методов (1H, 13C, 19F и 11B ЯМР спектроскопия, элементный анализ, хромато-масс-спектрометрия высокого разрешения, ВЭЖХ, поляриметрия). В Уральском НИИ фтизиопульмонологии (Екатеринбург) изучена специфическая туберкулостатическая активность 10 конъюгатов пурина и 2-аминопурина, синтезированных в рамках выполнения проекта в 2020-2021 гг., в отношении микобактерий туберкулеза H37Rv с использованием REMA-метода, препарат сравнения - изониазид. Проведенные исследования показали, что исследованные конъюгаты пурина/2-аминопурина существенно уступают по туберкулостатической активности соединению-лидеру N-(2-аминопурин-6-ил)глицил-(S)-глутаминовой кислоте). Наиболее активными из изученных в 2021 г. соединений оказались конъюгаты пурина, в которых остаток дифторбензоксазина присоединен через фрагмент омега-аминокислот с длинной полиметиленовой цепочкой. Представляет интерес дальнейшие работы по модификации структуры указанных соединений с целью получения активных антимикобактериальных агентов. В Институте вирусологии им. Д.И. Ивановского ФГБУ НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи МЗ РФ (Москва) проведено изучение противовирусной активности новых конъюгатов пурина, производных адамантана и нидо-карборана (16 соединений), в отношении эталонного штамма вируса герпеса простого типа 1 (HSV-1) и штамма, глубоко резистентного к ацикловиру, на клетках Vero E6. В качестве препаратов сравнения использовали ацикловир и фоскарнет (гексагидрат фосфоноформиата натрия). Большая часть изученных соединений является малотоксичными в отношении культуры клеток Vero E6 (CD50 >> 1000 µМ). Наибольшей активностью в отношении HSV-1 и высокой избирательностью антивирусного действия обладают конъюгаты пурина и рацемического 3-метил-дифторбензоксазина, присоединённого через фрагменты 9-аминононановой и 10-аминодекановой кислот (индекс селективности SI = 19 и 16). Также высокую избирательностью противовирусного действия проявили конъюгат пурина с N-(6-аминогексаноил)бензоксазином и конъюгат 2-аминопурина с 3-(6-аммониогексаноиламино)-нидо-карбораном (SI = 19 и 13 соответственно). Следует отметить, что противовирусная активность всех изученных соединений сохраняется в отношении ацикловир-резистентного варианта HSV-1. Особого внимания заслуживает противогерпетическая активность конъюгата пурина с нидо-карбораном. В литературе нет сведений о противовирусной активности производных нидо-карборана в отношении HSV-1, это открывает большие перспективы для поиска в ряду нидо-карборанов новых противовирусных агентов. Изучение противогриппозной активности 12 соединений, синтезированных в рамках выполнения настоящего проекта, проведено в Санкт-Петербургском НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера в отношении эталонного штамма вируса гриппа A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) с помощью теста на подавление вирус-индуцированного цитопатического действия в культуре клеток MDCK. Некоторые соединения были также протестированы на способность ингибировать репродукцию вируса гриппа B/Florida/4/2006. В качестве препарата сравнения использовали осельтамивир (в форме осельтамивира карбоксилата). Жизнеспособность инфицированных и здоровых клеток оценивали с помощью МТТ-теста. Изученные соединения проявили низкую активность в отношении вируса гриппа A и низкую селективность. Оптимальными показателями активности и цитотоксичности в ряду изученных соединений обладал конъюгат 2-амино-6-хлорпиримидина и рацемического N-(6-аминогексаноил)-3-метилдифторбензоксазина. Этот факт дает возможность предположить, что синтез и исследование конъюгатов галоген-замещенных пуринов позволит выявить соединения, активные в отношении вируса гриппа. В связи с обнаруженной нами высокой цитотоксичностью конъюгатов пурина в опытах по исследованию противовирусной активности, проведено изучение цитотоксической активности 3-х N-[(пурин-6-ил)аминополиметиленкарбонил]-производных 3,4-дигидро-3-метил-7,8-дифтор-2H-[1,4]бензоксазина в отношении клеточных линий опухолей человека. Соединения исследованы в ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр имени Н.Н. Блохина» МЗ РФ (Москва). Изучение противоопухолевой активности соединений в опытах in vitro проводились с использованием МТТ-теста на четырех моделях линий опухолевых клеток и на фибробластах легкого человека (здоровые клетки). Показано, что инкубация опухолевых клеток различных линий в присутствии изученных соединений в течение 72 ч приводит к выраженному цитотоксическому эффекту. Наиболее высокую чувствительность к исследуемым веществам среди использованных клеточных линий проявили клетки линии карциномы желудка человека SNU-1 и острого Т-лимфобластного лейкоза Jurkat. Наибольшую активность проявлял конъюгат пурина и рацемического 3-метил-дифторбензоксазина, присоединённый через остаток 11-аминоундекановой кислоты. В Центре биологических исследований и биоинженерии ЦНИЛ ФГБУВО «Сибирский государственный медицинский университет» (Томск) проведены исследования острой токсичности этого соединения в эксперименте на мышах линии BALB/c (внутрибрюшинное введение в дозе 500 мг/кг). Гибели животных не наблюдали в течение 30 дней, что свидетельствует о том, что вещество мало токсично. В 2021 г. продолжено изучение возможных механизмов биологического действия синтезированных соединений для выявления связей «структура-активность». В результате выполнения проекта был синтезирован широкий ряд конъюгатов, в которых пурин или его аналоги связаны посредством линкера с разнообразными аминами. Среди полученных соединений выявлены вещества, обладающие значительной активностью в отношении вируса простого герпеса типа 1 (HSV-1), в том числе, и в отношении ацикловир-устойчивого штамма. Наиболее активными оказались конъюгаты пурина с бензоксазином, причем как содержащим заместители, так и не содержащим их. Наиболее активным представителем этого ряда соединений является конъюгат пурина с (S)-энантиомером 3,4-дигидро-3-метил-7,8-дифтор-2H-[1,4]бензоксазина, присоединённым через линкер – остаток 6-аминогексановой кислоты. Как было установлено, активность этого соединения зависит от стереоконфигурации атома углерода, входящего в фрагмент бензоксазина, что также свидетельствует о важной роли данного фрагмента. Несколько меньшую активность проявили производные бензотиазина. Производные шестичленных гетероциклов (пиперидина, морфолина, тиоморфолина) были, как правило, неактивны. Впервые противогерпетическая активность выявлена у производных нидо-карборана. Наилучший результат получен для соединений, длина линкера в которых составляла 5 метиленовых звеньев. При уменьшении длины линкера антигерпетическая активность несколько уменьшалась, при увеличении возрастала токсичность. Полученные результаты свидетельствуют о перспективности поиска в ряду конъюгатов пурина соединений, проявляющих высокую активность в отношении вируса герпеса HSV-1 с целью последующего создания на их основе новых лекарственных средств. Вместе с тем, вопрос о механизме действия (биомишени) испытуемых соединений остается открытым. В настоящее время продолжается экспериментальная работа по получению резистентного варианта вируса и установлению мутаций, ассоциированных со снижением чувствительности вируса к соединениям указанной группы, с целью определения биологической мишени. В 2021 г. в рамках выполнения проекта опубликовано пять статей в изданиях, индексируемых в базах данных «Сеть науки» (Web of Science Core Collection) или «Скопус» (Scopus), из них две статьи опубликованы в журналах первого квартиля Q1: Coordination Chemistry Reviews (импакт-фактор 22,315) и Amino Acids (импакт-фактор 3,520). Результаты работ по проекту представлены на 3-х российских и международных конференциях в виде 2-х стендовых докладов, 1 устного выступления и 2-х приглашенных докладов. По материалам проведенных исследований противоопухолевой активности in vitro оформлена заявка на изобретение РФ и получен патент RU 2760305 «4-[(Пурин-6-ил)аминополиметиленкарбонил]-производные 3,4-дигидро-3-метил-7,8-дифтор-2Н-[1,4]бензоксазина, обладающие противоопухолевой активностью»; заявл. 26.04.2021, опубл. 23.11.2021.

 

Публикации

1. Воздвиженская О.А., Андронова В.Л., Галегов Г.А., Левит Г.Л., Краснов В.П., Чарушин В.Н. Synthesis and antiherpetic activity of novel purine conjugates with 7,8-difluoro-3-methyl-3,4-dihydro-2H-1,4-benzoxazine Chemistry of Heterocyclic Compounds, V. 57(4), 490–497 (год публикации - 2021).

2. Груздев Д.А., Вакаров С.А., Королева М.А., Барташевич Е.В., Тумашов А.А., Чулаков Е.Н., Ежикова М.А., Кодесс М.И., Левит Г.Л., Краснов В.П. Acylative kinetic resolution of racemic methyl-substituted cyclic alkylamines with 2,5-dioxopyrrolidin-1-yl (R)-2-phenoxypropanoate Organic & Biomolecular Chemistry, Iss. 4, Vol. 20, pp. 862-869 (год публикации - 2022).

3. Груздев Д.А., Левит Г.Л., Краснов В.П., Чарушин В.Н. Carborane-containing amino acids and peptides: Synthesis, properties and applications Coordination Chemistry Reviews, 433, 213753 (год публикации - 2021).

4. Краснов В.П., Воздвиженская О.А., Левит Г.Л., Груздев Д.А., Барышникова М.А., Першина А.Г., Брикунова О.Я., Чарушин В.Н. 4-[(Пурин-6-ил)аминополиметиленкарбонил]-производные 3,4-дигидро-3-метил-7,8-дифтор-2Н-[1,4]бензоксазина, обладающие противоопухолевой активностью -, 2760305 (год публикации - ).

5. Краснов В.П., Зарубаев В.В., Груздев Д.А., Воздвиженская О.А., Вакаров С.А., Мусияк В.В., Чулаков Е.Н., Волобуева А.С., Синегубова Е.О., Ежикова М.А., Кодесс М.И., Левит Г.Л., Чарушин В.Н. Novel purine conjugates with N-heterocycles: synthesis and anti-influenza activity Chemistry of Heterocyclic Compounds, V. 57(4), 498–504 (год публикации - 2021).

6. Мусияк В.В., Борисевич С.С., Груздев Д.А., Вигоров А.Ю., Низова И.А., Матвеева Т.В., Левит Г.Л., Краснов В.П. Molecular docking of the C(6)-substituted purine derivatives into the active site of Mycobacterium tuberculosis glutamine synthetase FEBS Open Bio, V. 11 (Suppl. 1), p. 302, P-06.2-10 (год публикации - 2021).

7. Мусияк В.В., Низова И.А., Чулаков Е.Н., Садретдинова Л.Ш., Тумашов А.А., Левит Г.Л., Краснов В.П. Stereochemical aspects in the synthesis of novel N‑(purin‑6‑yl) dipeptides as potential antimycobacterial agents Amino Acids, V. 53 (3), 407-415 (год публикации - 2021).


Возможность практического использования результатов
не указано