КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 19-15-00053

НазваниеНовые экспериментальные модели и биомаркеры взаимосвязи стресса и нейровоспалительных процессов

РуководительКалуев Алан Валерьевич, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регионфедеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Санкт-Петербургский государственный университет", г Санкт-Петербург

Годы выполнения при поддержке РНФ 2019 - 2021 

КонкурсКонкурс 2019 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины, 05-101 - Экспериментальная медицина

Ключевые словастресс, нейровоспаление, крысы, зебраданио (Danio rerio), патогенез, биомаркер, экспериментальная модель, скрининг

Код ГРНТИ34.00.00


СтатусУспешно завершен


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
Стрессорные расстройства являются главным фактором в развитии заболеваний центральной нервной системы (ЦНС). Вызванные стрессом аффективные расстройства тревожно-депрессивного спектра являются наиболее распространенными психическими заболеваниями в мире. По данным Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ, 2014), тревоге и депрессии подвержены 15-25% населения мира вне зависимости от расовой принадлежности, региона и уровня благосостояния. Таким образом, лечение и профилактика данных расстройств является центральной задачей современной биомедицины. Затраты на лечение стрессорных заболеваний мозга также существенны и составляют в год 0.25-0.5% валового национального продукта развитых стран мира (Kessler and Greenberg, 2002). По статистике МЗ РФ за последние 10 лет, тревожно-депрессивные расстройства чрезвычайно распространены в России. Поэтому лечение стрессорных расстройств также является и важнейшей социально-экономической задачей в России. В то же время, главными проблемами при лечении стрессорных расстройств ЦНС являются их малоизученная нейробиологическая природа, устойчивость к терапии, хронический характер, высокий уровень коморбидности с другими заболеваниями, а также отсутствие эффективных терапевтических препаратов (Griebel and Holmes, 2013). В литературе также отмечают недостаточность новых экспериментальных моделей стресса и системных подходов к пониманию всего спектра факторов патогенеза, и необходимость инновационного поиска принципиально новых перспектив их терапии (Kalueff et al., 2007, Stewart et al., 2014, 2015). Учитывая, что стресс и воспаление представляют собой важнейшие аспекты существования организма в окружающей среде, выяснение молекулярных механизмов, которые регулируют их взаимосвязь и интегрируют два данных процесса, представляет собой также и важную биологическую задачу. Наряду со стрессом, нейровоспалительные процессы являются одним из ведущих факторов патогенеза ЦНС. Данные, полученные за последние годы, указывают на возможную тесную взаимосвязь между стрессом и нейровоспалительными процессами (Furtado and Katzman, 2015, Kim et al., 2015). Например, стрессорные изменения в активности глюкокортикоидных рецепторов и активация гипоталамо-гипофизарно-адреналовой системы (ГГАС) модулируют выделение провоспалительных цитокинов, которые в свою очередь не только вызывают воспаление, но и регулируют активность ГГАС (Kim et al., 2015). Анализ экспериментальных моделей и клинических данных также подтверждает взаимосвязь стрессорных и провоспалительных процессов (Furtado and Katzman, 2015, Kim et al., 2015). В то же время, остается невыясненной сама природа патогенетической взаимосвязи стресса и нейровоспаления. Например, неясно, являются ли стресс и нейровоспаление взаимными триггерами, или же существует общий молекулярный механизм патогенеза, который позволяет интегрировать стрессорные и нейровоспалительные процессы. В таком случае, данный гипотетический механизм может представлять собой принципиально новую мишень для разработки фармакотерапии наиболее распространенных заболеваний ЦНС. С учетом отсутствия за последние 50 лет концептуального прогресса в поиске принципиально новых средств терапии стресса (Griebel and Holmes, 2013, Stewart et al., 2014, 2015), решение данной биомедицинской задачи является крайне значимым. Предлагаемый проект исследования актуален, поскольку он непосредственно направлен на экспериментальное решение этой важной биомедицинской проблемы. Пилотные неопубликованные первичные данные, полученные авторами (см. далее), указывают на возможную интеграцию стрессорных и нейровоспалительных процессов в рамках единого механизма. Создание и применение новых моделей на крысах и зебраданио (Danio rerio) представляет собой уникальный методический и концептуальный подход к решению данной проблемы, поскольку он позволяет не только выявить общие молекулярные процессы (вовлеченные в стресс и нейровоспаление), но и оценить роль эволюционной значимости данных общих механизмов путем сопоставления полученных биомаркеров у двух филогенетически отдаленных групп позвоночных животных - млекопитающих и рыб (Zhu et al., 2012). Основная научная проблема представленного проекта - выявление новых общих патофизиологических механизмов, интегрирующих стрессорные и нейровоспалительные процессы ЦНС, и поиск новых путей их коррекции. Проект также ставит задачу разработать новые модели стресса на основе зебраданио и крыс, и охарактеризовать динамику про- и противоспалительных биомаркеров (цитокины, нейротрофины, экспрессия ключевых мозговых генов), а также нейрохимические изменения в данных моделях. Долгосрочными целями исследования являются развитие новых методов биоскрининга и биомаркеров in-vivo, освоение коллективом новых методик исследования (существенно раcширяющих арсенал методических подходов), а также возможный вывод на рынок новых услуг по доклиническому биоскринингу препаратов и создание на их основе международных платформ в России для тестирования биологически активных веществ in vivo. Коллектив является ведущей лабораторией РФ по использованию зебраданио для нейробиоскрининга, и поэтому конкурентноспособность разработок по проекту в целом оценивается как достаточно высокая. Предложенный подход обладает высокой степенью научной новизны, так как он использует новые модели (зебраданио), проводит широкомасштабный скрининг поведенческих, геномных и молекулярных биомаркеров, а также применяет новейшие методики биоскрининга и химико-биологического анализа тканей, разработанные участниками. Применение моделей на зебраданио в данной работе также обладает научно-прикладной новизной и актуальностью, поскольку данный организм практически не используется в России при моделировании патогенеза ЦНС. Использование комплексных биоинформационных подходов к полученным результатам, в свою очередь, обеспечит трансляционную актуальность проекта, поскольку результаты, полученные в ходе НИР на животных моделях, будут непосредственно сопоставлены с клиническими данными. Выявление таких общих молекулярных путей позволит опрелелить новые мишени для создания новой эффективной терапии стрессорных заболеваний ЦНС. Перспектива разработки на основе зебраданио новых эффективных платформ для скрининга биологически активных веществ и лекарственных средств также отражает высокую научно-практическую новизну проекта, и в случае его реализации может привести к получению результатов, способных к правовой охране. Проект представлен динамичным продуктивным научным колективом, созданным в СПбГУ 4 года назад и активно работающим на постоянной основе в России. Руководитель проекта проф. А.В. Калуев (Индекс Хирша 56) осуществляет руководство 3 молодыми учеными (научными сотрудниками), 5 аспирантами дневной формы обучения и студентами в России, которые активно публикуются в международной печати и успешно выигрывают российские гранты и конкурны для молодых ученых РФ. Лаборатория в настоящее время поддерживается средствами СПбГУ и грантами РФФИ. Ранее, лаборатория не получала поддержки РНФ. Адекватное финансирование по линии РНФ позволит создать достойные условия для работы в России активному колективу НИР и тем самым увеличить его конкурентноспособность на мировом уровне.

Ожидаемые результаты
Основными целями настоящего проекта НИР являются 1) создание новых моделей стресса на основе зебраданио и крыс, 2) характеристика динамики про- и противоспалительных биомаркеров (цитокины, нейротрофины, экспрессия ключевых мозговых генов) и нейрохимических изменений в данных моделях, 3) выявление общих патофизиологических механизмов, интегрирующих стрессорные и нейровоспалительные процессы, и 4) поиск новых путей их коррекции. В ходе выполнения НИР ожидается создание новых экспериментальных моделей стрессорного патогенеза для последующего изучения интеграции стрессорных и нейровоспалительных процессов у крыс и зебраданио. Ожидается сходная модуляция стрессорного патогенеза на поведенческом и физиологическом уровнях у крыс и зебраданио в сторону уменьшения при действии СИОЗС, а также потенцирование патогенеза при действии ЛПС. При анализе биомаркеров воспаления будет проведена оценка уровня про- и противовоспалительных цитокинов, нейротрофных факторов, их рецепторов, и уровня экспрессии их генов в мозге, а также нейрохимических изменений в мозге крыс и зебраданио в созданной модели стресса. Будет проведено сравнение уровня данных биомаркеров в контроле, при стрессе, на фоне коррекции СИОЗС, а также при потенцировании воспаления на фоне введения ЛПС. Ожидается сходная динамика молекулярных биомаркеров у крыс и зебраданио при стрессе, а также подобная модуляция при действии СИОЗС и ЛПС. Параллельно с анализом уровней белковых биомаркеров, будет проведено определение изменения уровней транскрипционной активности транскрибируемых участков генома в образцах мозга с помощью полно-транскриптомного секвенирования РНК (RNA-seq на базе РЦ "Биобанк" СПбГУ). Ожидается, что экспрессия генов ряда провоспалительных цитокинов и их рецепторов в мозге будет повышена при стрессе и действии ДЛП, и снижена при действии СИОЗС. Одна из важных задач проекта - выявление общих (эволюционно значимых) молекулярных механизмов патологической интеграции стрессорных и нейровоспалительных процессов у рыб (зебраданио) и высших позвоночных (крысы). Для решения данной задачи будут применены методы сравнительного анализа общих и видоспецифичных маркеров, полученных в ходе выполнения НИР. В частности, будут проанализированы молекулярные биомаркеры (и их молекулярные сети) 1) общие для двух видов, а также 2) видо-специфичные геномные и протеомные данные. При разработке и сравнительном анализе новых методов коррекции стрессорного патогенеза на основе 1) антистрессорных, 2) противовоспалительных и 3) комбинированных препаратов будет проанализирована динамика выявленных ранее поведенческих и молекулярных биомаркеров интегративного стрессорно-нейровоспалительного патогенеза при коррекции антистрессорными (СИОЗС), противовоспалительными (эйкозапентаеновая кислота ЭПК) и комбинированными (СИОЗС+ЭПК) препаратами. Ожидается, что поведенческие, геномные и физиологические биомаркеры стресса у крыс и зебраданио будут существенно снижены при действии не только СИОЗС, но и ЭПК. При этом ЭПК в комбинации с СИОЗС может оказать потенциирующее синергичное действие на поведенческие, физиологические и геномные биомаркеры стресса, и препятствовать усилению стрессорных ответов при действии ЛПС. Ожидается, что выполнение данной задачи позволит выявить перспективы коррекции стрессорных расстройств не только традиционными методами (СИОЗС), но и принципиально новой группой лекарственных средств - препаратами противовоспалительного профиля. Анализ молекулярных сетей (для выявления общих механизмов действия и функциональной классификации интеракторов) на основе моделей известных взаимодействия белков-продуктов генов будет проводиться с использованием открытых баз данных Blast, Geneweaver и др. по методикам, разработанных авторами (Roth et al., 2013, Nguyen et al., 2014). В ходе работы также будет проведен анализ трансляционной значимости полученных результатов и моделей путем выявления их соответствия имеющимся клиническим данным, с целью разработки новых стратегий терапии. В ходе выполнения данного этапа работы коллективом НИР с дистанционным привлечением экспертов из США и Канады (в рамках международного сотрудничества) будут проанализированы имеющиеся клинические данные (полно-геномные ассоциации GWAS, анализ генетических полиморфизмов) по открытым базам данных международных консорциумов, с целью выявления ассоциаций между выявленными молекулярными маркерами стресса (у крыс и зебраданио) и клиническими данными по ортологам указанных биомаркеров у человека. Ожидается, что ряд выявленных общих биомаркеров стресса и нейровоспаления на животных будет соответствовать клиническим данным, полученным для ортологов этих генов у человека, тем самым подтверждая валидность и трансляционную значимость результатов, полученных в ходе НИР на животных. Научно-практическая значимость результатов НИР: 1. Коллективом проекта прогнозируется широкий круг возможных потребителей результатов НИР. В частности, перспектива создания новых лекарственных средств на основе коррекции интегрированного стрессорного и воспалительного патогенеза будет интересна отечественным и зарубежным производителям антистрессорных лекарственных препаратов. В случае успеха, возможно дальнейшее финансирование с привлечением государственных, международных и частных источников, которое позволит участникам-партнерам перейти к комплексным доклиническим и клиническим испытаниям новых препаратов. 2. Перспектива создания биоскрининговых платформ in-vivo на основе новых биомаркеров стресса и воспаления будет интересна отечественным и зарубежным производителям широкого спектра лекарственных препаратов. Возможность использования данных платформ для токсикологических исследований будет интересна производителям широкого спектра продукции потребления (бытовая химия, удобрения, продукты питания). Разработка и валидация в ходе НИР новых биоскрининговых моделей на основе зебраданио позволит интенсифицировать тестирование in-vivo за счет использования высокоэффективных и экономически выгодных организмов (зебраданио) на начальных стадиях доклинических испытаний, с последующим тестированием молекул-кандидатов на гораздо более дорогостоящих моделях (на крысах и мышах). Данная перспектива использования платформ на основе зебраданио будет интересна отечественным и зарубежным производителям лекарственных препаратов. 3. Перспектива использования противовоспалительных средств для коррекции стрессорного патогенеза позволит привлечь к исследованиям производителей пищевых биодобавок на основе омега-3-полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК), с последующей перспективой клинических испытаний. 4. Поддержка за счет гранта РНФ мероприятий по информированию общественности о ходе и результатах их выполнения позволит расширить сотрудничество за счет активного привлечения российских компаний, в том числе отечественных разработчиков и производителей лекарственных препаратов, биодобавок и пищевых продуктов. 5. Использование биоинформационных подходов к полученным результатам, в свою очередь, обеспечит трансляционную и практическую актуальность проекта, поскольку результаты, полученные в ходе НИР на двух эволюционно отдаленных видах животных (крысы и рыбы), будут сопоставлены с доступными клиническими данными и биомаркерами, и могут привести к выявлению новых молекулярных мишеней для разработки перспективных антистрессорных препаратов на основе корректоров мозговых воспалительных процессов. В то же время, существенен и вклад проекта в развитие нейронаук и молекулярных нейротехнологий в России, поскольку результаты НИР могут быть использованы для обоснования дальнейших клинических и фундаментальных исследований в данной области. 6. В соответствии с требованиями РНФ, мероприятия по информированию общественности о ходе и результатах выполнения исследований также составят важную часть результатов НИР. В частности, участники проекта обеспечат своевременную публикацию результатов исследований в авторитетных международных рецензируемых изданиях с импакт-фактором не менее 3,0 (Q1). При публикации принятых к печати статей, по возможности, будет выбрано спонсирование (за счет средств гранта) модели "открытый доступ", что обеспечит полный доступ международного научного сообщества к данным, содержащимся в статьях, опубликованных по материалам исследования. Результаты исследования будут представлены в качестве устных и стендовых докладов с публикацией тезисов на международных научных конференциях, включая ежегодные конференции Society for Neuroscience и Experimental Biology (США), и Съезд Физиологов России. Результаты проекта будут доложены на ежегодной конференции Международного общества по изучению стрессорного поведения (ISBS) в 2019-2021 гг. в России (Санкт-Петербург), и на Международном симпозиуме по нейроиммунологии стресса, проводимом на Тайване в 2019-2021 гг. при участии и поддержке Международного Общества Психонейроиммунологов (PNIRS). Результаты исследований будут включены в лекции в рамках читаемых участниками курсов, представлены в виде семинаров (по приглашениям других университетов и научных обществ), а также размещены на сайте коллектива НИР, который будет создан для более широкого распространения данных, полученных в ходе проекта.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2019 году
В рамках отчетного года по проекту была разработана новая модель хронического стресса и нейровоспаления у зебраданио. Для этого был использован хронический 8 недельный сильный непредсказуемый стресс, в котором более 20 стрессоров чередуются случайным образом, а животное подвергается воздействию 4 разных стрессоров за день. Были использованы такие стрессоры как новизна среды, скученность, яркий свет, вибрация, гипо- и гипертермия, темнота, социальная изоляция, голод, предъявление хищника, провоцирование реакции избегания при помощи сачка, громкий звук и т.д. После экспозиции стрессора, стрессированные рыбы и рыбы не подвергнутые действию стресса (контрольные; n=20 в каждой группе) были подвергнуты поведенческой батарее, направленной на изучение поведения, ассоциирующегося с тревогой и моторных функций. Для этого, рыбы были последовательно помещены в Тест Незнакомого Аквариума (ТНА), Темно-Светлый Аквариум (ТСА) и Тест на Построение Косяка (ТПК). Поведенческие показатели в тестах оценивались автоматически при помощи программы Noldus Ethivision XT13, Нидерланды. В ТНА стрессированные рыбы проводили статистически значимо меньшее время в верхней половине аквариума, сделали меньше выходов на верх и проплыли меньшую дистанцию. В ТСА стрессированные рыбы проводили статистически значимо больше времени в темном отсеке аквариума. В ТПК рыбы образовывали более плотные косяки, что можно увидеть по показателю среднего расстояния между каждой рыбой. Таким образом, поведенческие тесты указывают на развитие выраженного аффективно-тревожного фенотипа, сопровождающего гиполокомоцией, характерной для моделей нейровоспалительных расстройств у зебраданио (например, болезни Паркинсона и депрессоподобными моделями, в т.ч. фармакологическими, такими как воздействие резерпина). После поведенческого тестирования рыбы были эвтанизированы с использованием ледяной воды, были собраны и криоконсервированы образцы теленцефалона и тела рыб. Используя метод ПЦР реального времени и имунноферментного анализа ELISA, были определены уровни экспрессии и количества противовоспалительных цитокинов интерлейкинов ИЛ-4, 10, 13, ТФР-бета и провоспалительных цитокинов ИЛ-1, 2, 6, 8 и интерферона, нейротрофные факторы (и их рецепторы), включая фактор роста нервов NGF, мозговой фактор роста BDNF, и нейротрофины НТ-3, 4, 5 и 6, а также цитокины с малоизученной функцией - эндотелиальный фактор роста сосудов VEGF, интерлейкины ИЛ-7 и 15. По результатам молекулярных исследований также были обнаружены следующие изменения: Хронический стресс повышает уровень кортизола и усиливает экспрессию ИЛ-1 и ИЛ-6 (но не ИЛ-4), а также TNFa, IFNgamma и BDNF в мозге рыб. Было показано повышение экспрессии генов-биомаркеров активации М1-подтипа микроглии мозга зебраданио (ИЛ-1beta, iNOS, но не МНС-2), повышение экспрессии генов-биомаркеров активации М2-подтипа микроглии (egr-2, arg-1, но не CD206), не выявлено изменение экспрессии гена-биомаркера М0-подтипа микроглии (CD11b), обнаружена активация экспрессии астроцитарного А-1 биомаркера С4В (но не С3), а также снижение экспрессии биомаркера А2-подтипа (ЕМР-1, но не S100a). Кроме того, показана активация экспрессии эпигенетических генов ферментов ДНК метилирования и гистон-де/ацетилирования (dnmt-3a, dnmt-3b, hat-1, hdac-4, kmt-2a) и апоптотических генов-биомаркеров bcl-2 и caspase-3 (но не Bax). Таким образом, на данном этапе выполнения проекта, можно сделать вывод о том, что хронический сильный непредсказуемый стресс вызывает у зебраданио аффективный, нейровоспалительный патогенез ЦНС зебраданио, который сопровождается соответственными поведенческими нарушениями - тревожностью и гиполокомоцией и молекулярными нарушениями - ростом числа провоспалительных и снижением числа противовоспалительных биомаркеров, вовлечением нейротрофинов, а также эпигенетических и про-апоптотических процессов, на фоне перераспределения активности микроглии и астроцитов (по М1-М2 и А1-А2 подтипам) на фоне стресса. Дальнейшие исследования по проекту будут направлены на определение потенциала коррекции данного состояния с использованием эйкозапентаеновой кислоты, селективных ингибиторов обратного захвата серотонина и комбинированных препаратов, а также изучению эволюционно консервативных черт стрессорного патогенеза между зебраданио и крысами. В том числе, для решения данной задачи будет применен метод исследования транскриптома - полное мРНК секвенирование, по результатам которого будут построены и сравнены молекулярные сети, ответственные за нейровоспалительный патогенез. Материалы для полнотранскриптомного анализа мозга зебраданио были собраны и подготовлены для анализа в конце 2019-начале 2020 гг.

 

Публикации

1. Генарио Р., Гиакомини А.С., де Абреу М.С., Маркон Л., Демин К.А., Калуев А.В. Sex differences in adult zebrafish anxiolytic-like responses to diazepam and melatonin Neuroscience Letters, Номер 714 (год публикации - 2020).

2. де Абреу М.С., Максимино К., Банха Ф., Анастасио П.М., Демин К.А., Калуев А.В., Соарес М.С. Emotional behavior in aquatic organisms? Lessons from crayfish and zebrafish Journal of Neuroscience Research, - (год публикации - 2019).

3. Демин К.А., Мешалкина Д.А., Волгин А.Д., Яковлев О.В., де Абреу М.С., Алексеева П.А., Фриенд А.Д., Лакстыгал А.М., Забегалов К., Амстиславская Т.Г., Стрекалова Т., Бао В., Калуев А.В. Developing zebrafish experimental animal models relevant to schizophrenia Neuroscience & Biobehavioral Reviews, Номер 105, стр. 126-133 October 2019 (год публикации - 2019).

4. Коста Ф.В., Канзиан Д., Стефанелло Ф.В., Калуев А.В., Роземберг Д.Б. Naloxone prolongs abdominal constriction writhing-like behavior in a zebrafish-based pain model Neuroscience Letters, Том 708 (год публикации - 2019).

5. Кротова Н.А., Лакстыгал А.М., Таранов А.С., Ильин Н.П., Бытов М.В., Волгин А.Д., Амстиславская Т.Г., Демин К.А., Калуев А.В. Зебраданио (zebrafish) как новая перспективная модель в трансляционной нейробиологии Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова, Том 105, Номер 11, стр. 1417–1435 (год публикации - 2019).

6. Чересиз С.В., Волгин А.Д., Кокорина А., Баширзаде А.А.О., Демин К.А. де Абреу М.С., Амстиславская Т.Г., Калуев А.В. Understanding neurobehavioral genetics of zebrafish Journal of Neurogenetics, - (год публикации - 2019).


Аннотация результатов, полученных в 2020 году
На данном этапе выполнения НИР выполнялось комплексное исследование поведенческих и молекулярных эффектов продолжительного (12-недель) хронического стресса и потенциала фармакологической коррекции и/или усиления отклонений у крыс линии Wistar и Danio rerio дикого типа. В обоих исследованиях группы включали в себя контрольную группу, группу, получившую воздействие только хроническим стрессом, а также 5 групп, с 9 недели получавших дополнительно к стрессу воздействие флуоксетином, эйкозапентаеновой, липополисахаридом, а также комбинациями данных препаратов – Флу+ЭПК, и Флу+ЛПС. Флуоксетин был выбран как один из наиболее изученных и широко используемых антидепрессантов. ЛПС был выбран как агент для индуцирования воспалительных процессов. ЭПК была выбрана в качестве противовоспалительного агента. Стрессоры применялись ежедневно, при этом не повторялись, не образовывали устойчивых комбинаций и не были прикреплены к определенному дню. Для изучения поведенческих эффектов продолжительного стресса и его фармакологической модуляции были использованы Тест Незнакомого Аквариума (ТНА), Тест на Построение Косяка (ТПК) и тест Условного Избегания Места (УИМ). В ТНА были изучены такие показатели как скорость, Количество, продолжительность и латентный период переходов в верхнюю часть аквариума. В ТПК рыбы помещались группами по 4-6 особей и их косяки фотографировались, затем на каждой фотографии оценивалось среднее расстояние между особями. В УИМ использовался аквариум разделенный на 2 отсека – черный и белый. В черном отсеке по боковым стенкам были установлены металлические пластины, подключенные к генератору электрического тока. В первый день рыбы обучались в течение 4 часов избегать входа в черный отсек. На следующий день рыбы тестировались в том же аквариуме с выключенным током (5 мин). Оценивались: латентный период, число и продолжительность нахождения в черном отсеке. Для изучения нейрохимических эффектов при помощи метода высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимической детекцией (ВЭЖХ-ЭД) были определены концентрации норэпинефрина, серотонина, дофамина и их метаболитов 5-гидроксииндолуксусной кислоты, 3,4-дигидроксифенилуксусной кислоты и гомованиловой кислоты в мозге зебраданио. По окончанию моделирования хронического стресса крыс животные будут протестированы в тестах «Открытое поле» и «Приподнятый крестообразный лабиринт» и эвтанизированы. Образцы миндалины и гиппокампа будут собраны и заморожены при -80 для дальнейшего анализа методами ВЭЖХ-ЭД, количественного ПЦР и РНК-секвенирования. Стрессорные воздействия (в т.ч. ЛПС) привели к увеличению тревожного поведения в ТНА, в тоже время флуоксетин, в различных комбинациях с другими препаратами, оказался эффективным для восстановления данного поведения. Однако ЭПК не оказало положительного эффекта на тревожное поведение Danio rerio. Аналогично ТНА, в тесте ТПК стрессорные воздействия оказали выраженное тревожное воздействие, тогда как флуоксетин нормализовал поведение в тесте. В тоже время в тесте УИМ не было выявлено статистически значимых изменений относительно контрольной группы. При этом, стрессорные воздействия привели к увеличению концентрации норэпинефрина в мозге Danio rerio, а ЛПС также увеличил концентрацию дофамина и снизил отношение метаболита дофамина к дофамину в мозге. В группах флуоксетина и флуоксетина+ЭПК наблюдалось увеличение концентрации метаболита серотонина, а в группе флуоксетина+ЭПК также наблюдалось повышение отношения метаболита серотонина к серотонину. Было также проведено пилотное исследование экспрессии генов образцов цельного мозга у рыб, подвергшихся стрессированию и рыб, подвергавшихся параллельно воздействию флуоксетина. Было определено 196 генов, изменивших свою экспрессию (130 снизивших и 66 увеличивших) в стрессированной группе против контрольной группы, а также 49 генов, изменивших свою экспрессию (49 снизивших и 15 повысивших) в группе флуоксетина против контрольной группы. 35 из этих генов (25 снизивших и 10 повысивших) изменили свою экспрессию в одну и туже сторону, относительно контроля, вероятно представляя собой гены устойчивые к воздействию антидепрессантов. Более того, было выявлено 18 генов (3 снизивших и 15 повысивших экспрессию), статистически значимо отличающихся между группой флуоксетина и стрессированной группой.

 

Публикации

1. - Рыбки зебраданио помогут бороться с хроническим стрессом NakedScience.ru, 10.12.2020 (год публикации - ).

2. Ванг Ж., Ванг Д., Ху Г., Янг Л., Ян Д., Ванг М., Серикули Н., Алфишов Е., Амстиславская Т.Г., Демин К.А., де Абреу М.С., Забегалов К.Н., Калуев А.В. A new method for vibration-based neurophenotyping of zebrafish Journal of Neuroscience Methods, том 333 (год публикации - 2020).

3. Волгин А., Янг Л., Амстиславская Т., Демин К., Ванг Д., Ян Д., Ванг Ж., Ванг М., Алфишов Е., Ху Г., Серикули Н., Шевырин В., Вапплер-Гузетта Е., де Абреу М., Калуев А. DARK Classics in Chemical Neuroscience: Kava ACS Chemical Neuroscience, 11, 23, 3893-3904 (год публикации - 2020).

4. Генарио Р., де Абреу М.С., Гиакомини А.С., Демин К.А., Калуев А.В. Sex differences in behavior and neuropharmacology of zebrafish European Journal of Neuroscience, - (год публикации - 2019).

5. Гиакомини А.К., Буено Б.В., Маркон Л., Сколари Н., Генарио Р., Демин К.А., Колесникова Т.О., Калуев А.В., де Абреу М.С. An acetylcholinesterase inhibitor, donepezil, increases anxiety and cortisol levels in adult zebrafish Journal of Psychopharmacology, - (год публикации - 2020).

6. Гиакоминии А.К., Тейхеира К.Х., Маркон Л., Сколари Н., Буено Б.В., Генарио Р., де Абреу Н.С., Демин К.А., Галстян Д.С., Калуев А.В., де Абреу М.С. Melatonin treatment reverses cognitive and endocrine deficits evoked by a 24-h light exposure in adult zebrafish Neuroscience Letters, - (год публикации - 2020).

7. де Абреу М.С., Гиакомини А.К., Генарио Р., Рецх Н., Карбони Ж., Лакстыгал А.М., Амстиславская Т.Г., Демин К.А., Леонард Б.Е., Влок М., Харви Б.Х., Пиато А., Барцеллос Л.Ж.Г., Калуев А.В. Non-pharmacological and pharmacological approaches for psychiatric disorders: Re-appraisal and insights from zebrafish models Pharmacology, Biochemistry and Behavior, - (год публикации - 2020).

8. де Абреу М.С., ЦВВ Гиакомини А., Генарио Р., Фонтана Б.Д., Паркер М.О., Маркон Л., Сколари Н., Буено Б., Демин К.А, Галстян Д., Колесникова Т.О., Амстиславская Т.Г., Забегалов К.Н., Стрекалова Т., Калуев А.В. Zebrafish models of impulsivity and impulse control disorders European Journal of Neuroscience, - (год публикации - 2020).

9. Демин К.А., Лакстыгал А.М., Волгин А.Д., де Cross-species Analyses of Intra-species Behavioral Differences in Mammals and Fish Neuroscience, - (год публикации - 2020).

10. Демин К.А., Лакстыгал А.М., Кротова Н.А., Машарский А., Understanding complex dynamics of behavioral, neurochemical and transcriptomic changes induced by prolonged chronic unpredictable stress in zebrafish Scientific Reports, - (год публикации - 2020).

11. Демин К.А., Таранов А.С., Ильин Н.П., Лакстыгал А.М., Волгин А.Д., де Абреу М.С. Стрекалова Т., Калуев А.В. Understanding neurobehavioral effects of acute and chronic stress in zebrafish Stress The International Journal on the Biology of Stress, - (год публикации - 2020).

12. Забегалов К.Н., Ванг Д., Янг Л., Ванг Ж., Ху Г., Серикули Н., Алпишов Е.Т., Кхацко С.Л., Жданов А., Демин К.А., Галстян Д.С., Волгин А.Д., де Абреу М.С., Стрекалова Т., Сонг К., Амстиславская Т.Г., Сысоев Ю., Мусиенко П.Е., Калуев А.В. Decoding the role of zebrafish neuroglia in CNS disease modeling Brain Research Bulletin, - (год публикации - 2020).

13. Лиегги К., Калуев А.В., Лоуренс К., Коллимор К. The Influence of Behavioral, Social, and Environmental Factors on Reproducibility and Replicability in Aquatic Animal Models ILAR Journal, - (год публикации - 2020).

14. Серикули Н., Алпишов Е.Т., Ванг Д., Ванг Ж., Янг Л., Ху Г., Ян Д., Демин К.А., Колесникова Т.О., Галстян Д., Амстимславская Т.Г., Бабашев А.М., Мор М.С., Ефимова Е.В., Гайнетдинов Р.Р., Стрекалова Т., де Абреу М.С., Сонг К., Калуев А.В. Effects of acute and chronic arecoline in adult zebrafish: Anxiolytic-like activity, elevated brain monoamines and the potential role of microglia Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry, - (год публикации - 2020).

15. Янг Л., Ванг Ж., Ванг Д., Ху Г., Лиу З., Ян Д., Серикули Н., Алпишов Е., Демин К.А., Стрекалова Т., де Абреу М.С., Сонг К., Калуев А.В. Delayed behavioral and genomic responses to acute combined stress in zebrafish, potentially relevant to PTSD and other stress-related disorders: Focus on neuroglia, neuroinflammation, apoptosis and epigenetic modulation Behavioural Brain Research, - (год публикации - 2020).


Аннотация результатов, полученных в 2021 году
На данном этапе выполнения НИР заканчивалось моделирование хронической стрессорной патологии у крыс линии Wistar. В исследовании экспериментальные группы (n=20) включали в себя контрольную группу (содержавшуюся в тех же условиях, но не получавшую воздействия стрессом и другими модуляторами), группу получившую воздействие только 12-недельным хроническим стрессом (по 2-4 стрессора в день), а также 5 групп с 8 недели (57 дня) получавших дополнительно к стрессу воздействие флуоксетином (10 мг/кг ежедневная внутрибрюшная инъекция), эйкозапентаеновой кислотой (ЭПК; 275 мг/кг перорально в день), внутрибрюшную инъекцию липополисахаридом (ЛПС; 0,1 мг/кг раз в неделю), а также комбинациями данных препаратов – флуоксетином и ЭПК, и флуоксетином и ЛПС (в тех же дозировках). Комплексная фармакологическая модуляция производилась широким спектром препаратов, что позволило определить эффекты как классических антидепрессантных препаратов, так и новых препаратов, изучающихся в контексте лечения аффективных расстройств, препаратам, усиливающим воспалительный эффект, а также их комбинации. Флуоксетин в данном исследовании был выбран как один из наиболее изученных антидепрессантов, который широко используется в исследованиях на грызунах. ЛПС, являющийся продуктом клеточной стенки грамотрицательной бактерии, был выбран как распространенный агент для индуцирования воспалительных процессов, тогда как ЭПК обладает противовоспалительными свойствами в некоторых исследованиях. Для моделирования продолжительного стресса у крыс использовался следующий протокол, согласно разработанному и отработанному раннее протоколу моделирования. Поведенческое тестирование было организовано в порядке увеличения интенсивности стресса с целью уменьшения эффекта предыдущего тестирования. Перед тестированием крысам давали адаптироваться в течение 2 ч к испытательной комнате и после тестирования возвращали в комнату содержания. Поведенческое тестирование проводилось между 10.00 и 17.00 часами и регистрировалось экшн-камерой SJ4000 (SJCAM, Шэньчжэнь, Китай) со скоростью 60 кадров/с. Экспериментаторы были не осведомлены о методах лечения во время поведенческого тестирования, включая статистический и видеоанализ, и использовали индивидуальные коды для идентификации крыс/групп. Ручной анализ поведенческих данных был проведен двумя высококвалифицированными наблюдателями (также не осведомленные о групповой принадлежности). Для изучения поведенческих эффектов были использованы тест открытого поля, тест приподнятого крестообразного лабиринта и тест груминга. Далее был произведен анализ дифференциальной экспрессии генов гиппокампа, а также анализ обогащения наборов генов и анализ сетей взаимодействий протеин-протеин. Для анализа эволюционно-консервативных транскриптомных биомаркеров хронического стресса, были использованы данные РНК-секвенирования зебраданио, данные РНК-секвенирования крыс, а также данные экспрессии гиппокампа депрессивных людей, полученных post mortem и опубликованные в открытых источниках Douglas Bell Canada Brain Bank (DBCBQ, Douglas Mental Health Institute, Verdun, Québec). Было предложено 4 различных метода, для сопоставления данных РНК-секвенирования между видами: 1) Непосредственное сравнение генов-ортологов при помощи диаграмм Венна 2) Исследование данных, пуллированных в один эксперимент при помощи построенной карты генов-ортологов 3) Сравнение результатов дифференциальной экспрессии и анализа обогащения наборов генов мета-аналитическими методами 4) Использование анализа экспрессии максимальных клик в построенной из ортологов сети PPI для дальнейшего мета-аналитического сравнения данных разных видов Таким образом, все заявленные на данном этапе работы были выполнены полностью, в том числе: 1.1 Была поставлена модели хронического непредсказуемого стресса, произведены запланированные фармакологические воздействия в модели, собраны поведенческие данные. 1.2. Собраны образцы мозга крыс 1.3. Проанализированы поведенческие данные эксперимента 1.5. Образцы мозга крыс проанализированы молекулярными методами (РНК-секвенирование) 1.6. Образцы мозга зебраданио проанализированы молекулярными методами (РНК-секвенирование) 2. Были специально разработаны и использованы новые методы биоинформатического анализа данных, для сравнения полученных данных между видами и между данными транскриптома депрессивных людей, для определения общих, эволюционно-консервативных транкскриптомных биомаркеров 3. Проведено обобщение результатов, опубликованы, а также поданы в журналы статьи, проведены выступления на конференциях Хронический стресс вызывал стойкий тревого-подобный фенотип в трех поведенческих тестах. При этом, классический серотонинергический антидепрессант флуоксетин, успешно корректировал данный фенотип, тогда как ЭПК оказал менее выраженное противотревожное воздействие, а ЛПС (не в комбинации) вызывал увеличение тревоги. С использованием данных методов по анализу эволюционно-консервативных транскриптомных биомаркеров были обнаружены 19 транскрипциомных факторов, оказывающих воздействие на экспрессию генов у всех трех видов. Методом мета-анализа данных транскриптома, состоящих из генов ортологов человека у каждого вида были также получены потенциальные гены и транскрипциомные факторы, оказывающие наиболее выраженное воздействие на транкриптом всех трех видов, при хроническом стрессорном воздействии и депрессии (3 с повышенной экспрессией или избыточной регуляцией (IKZF1, FEZF2 и VWF) и 3 с пониженной экспрессией или недостаточной регуляцией. (FLI1, ARNT и ERG)). Специально разработанный мета-аналитический анализ экспрессии максимальных клик в сети протеин-протеин взаимодействий, построенной из ортологов гена человека, было определено 253 гена, ответственных за патогенез аффективной патологии у всех трех видов. Из них, 6 оказались наиболее консервативными в своей экспрессии (GRIA1, DLG1, CDH1, THRB, PLCG2 и NGEF). В целом, все методы анализа данных транскриптома, подчеркивают роль передачи сигналов wnt, связанной с множеством белков wnt (например, WNT2, WNT3A, WNT7A и B, WNT8B, WNT10A), белок, обнаруженный в других анализах (GRIA1), рецепторы гормонов (TRHR и OXTR) и др. Как показывают недавние исследования, wnt-сигналинг оказывает выраженное модуляторное действие на воспалительные процессы, в том числе посредством NF-kB сигналинга, β-катенин/TCF-1 сигналинга и др. Таким образом, в данном отчетном периоде были получены следующие результаты: 1. Выявлены общие и специфичные для крыс поведенческие биомаркеры стрессорного и воспалительного патогенеза ЦНС. 2. Выявлены общие и специфичные для крыс эндокринные, нейрохимические, цитокиновые и нейротрофиновые биомаркеры стресса. 3. Изучен потенциал коррекции поведенческих и молекулярных отклонений возникающих у крыс при воздействии экспериментального стресса при помощи эйкозапентаеновой кислоты (ЭПК), антидепрессантов и комбинированных препаратов 4. Определены механизмы общие и специфичные для крыс коррекции нейровоспалительных процессов данными препаратами 5. Произведен биоинформационный анализ данных с целью выявления общих молекулярных сетей и физиологических механизмов, связанных с стрессом между крысами и зебраданио 6. Предложены потенциальные мишени (IKZF1, FEZF2, GRIA1, DLG1, CDH1, THRB, PLCG2 и NGEF) для фармакологического лечения стрессорных патологий, общие для позвоночных животных 7. Проведено обобщение результатов НИР, а также опубликованы или поданы в международные рецензируемые и индексируемые журналы статьи с результатами исследований, результаты работы доложены в 14 выступлениях членов коллектива НИР на профильных российских и международных научных конференциях в 2021 г. В настоящее время также поданы в печать и находятся на рассмотрении редакций дополнительные экспериментальные статьи по теме НИР. 8. Cформулирован долговременный стратегический план дальнейших научных исследований лаборатории на основе данных, полученных в ходе выполнения настоящего проекта НИР

 

Публикации

1. - Рыбки подсказали: Вивальди снижает стресс Уральский Федеральный, Уральский Федеральный, Издание Уральского Федерального Университета им. первого президента России Б.Н. Ельцина №4 (7036), 24 февраля 2021 г., стр. 6 (год публикации - ).

2. - Спокойствие, только спокойствие: рыбки-зебры показали, как преодолеть хронический стресс Пресс-служба РНФ, - (год публикации - ).

3. - Данио-рерио показали, как преодолеть хронический стресс Индикатор.ру, - (год публикации - ).

4. - Зебраданио поможет бороться с хроническим стрессом Журнал МФТИ "За Науку", - (год публикации - ).

5. - Ученые вылечили рыб от стресса антидепрессантами и иммуномодуляторами Газета.Ru, - (год публикации - ).

6. - Вивальди делает рыбок менее тревожными Нейроновости, - (год публикации - ).

7. - Chronic stress? Zebrafish to the rescue EurekAlert!, - (год публикации - ).

8. Ванг Д., Ху Г., Ванг Ж., Ян Д., Ванг М., Янг Л., Серикули Н., Алпишов Э., Демин К.А., Галстян Д.С., Амстиславская Т.Г., де Абреу М.С., Калуев А.В. Studying CNS effects of Traditional Chinese Medicine using zebrafish models Journal of Ethnopharmacology, т. 267, 1 Марта 2021, Epub 113383 (год публикации - 2021).

9. Ванг Д., Янг Л, Ванг Ж., Хуа Г., Лиу Ж., Ян Д., Серикули Н., Алфишов Э.Т., Демин К.А., Галстян Д.С., Стрекалова Н., де Абреу М.С., Амстиславская Т.Г., Калуев А.В. Behavioral and physiological effects of acute and chronic kava exposure in adult zebrafish Neurotoxicology and Teratology, т. 79, Май-Июнь 2020, Epub 106881 (год публикации - 2020).

10. Ванг Ж., Ванг Д., Ху Г., Янг Л., Лиу З., Ян Д., Серикули Н., Алпишов Э., Демин К.А., Стрекалова Т., Гил Барцеллос Л.Ж., Барцеллос Х.Х.А., Амстиславская Т.Г. де Абреу М.С., Калуев А.В. The role of auditory and vibration stimuli in zebrafish neurobehavioral models Behavioural Processes, т. 193, Декабрь 2021, Epub 104505 (год публикации - 2021).

11. де Абреу М.С., Демин К.А., Гиакомини А.Ц.В.В., Амстиславская Т.Г., Стрекалова Т., Маслов Г.О., Косицын Ю., Петерсен Е.В., Калуев А.В. Understanding how stress responses and stress-related behaviors have evolved in zebrafish and mammals Neurobiology of Stress, т. 15, Ноябрь 2021, Epub 100405 (год публикации - 2021).

12. Демин К.А., Колесникова Т.О., Галстян Д.С., Кротова Н.А., Ильин Н.П., Державина К.А., Левченко Н.А., Стрекалова Т., де Абреу М.С., Петерсен Е.В., Серединская М., Чернейко Ю.В., Косицын Ю.М., Сорокин Д.В., Забегалов К.Н. Мор М.С., Ефимова Е.В., Калуев А.В. Modulation of behavioral and neurochemical responses of adult zebrafish by fluoxetine, eicosapentaenoic acid and lipopolysaccharide in the prolonged chronic unpredictable stress model Scientific Reports, н. 1, т. 11., стр. 1-15, Epub 14289 (год публикации - 2021).

13. Демин К.А., Лакстыгал А.М., Черныш М.В., Кротова Н.А., Таранов А.С., Ильин Н.П., Серединская М.В., Тагава Н., Савва А.К., Мор М.С., Васютина М.Л., Ефимова Е.В., Колесникова Т.О., Гайнетдинов Р.Р., Стрекалова Т., Амстиславская Т.Г., де Абреу М.С. The zebrafish tail immobilization (ZTI) test as a new tool to assess stressrelated behavior and a potential screen for drugs affecting despair-like states Journal of Neuroscience Methods, т. 337, 1 Мая 2020, Epub 108637 (год публикации - 2020).

14. Марчетто Л., Барцеллос Л.Ж.Г., Коакоски Г., Соарес С.М., Помпермаиер А., Маффи В.С., Коста Р., да Силва К.Г., Зорзи Н.Р., Демин К.А., Калуев А.В, де Алкаранта Барцеллос Х.Х Auditory environmental enrichment prevents anxiety-like behavior, but not cortisol responses, evoked by 24-h social isolation in zebrafish Behavioural Brain Research, т. 404, 23 Апреля 2021, Epub 113169 (год публикации - 2021).

15. Мораес А.Б., Гиакомини А.Ц.В.В., Генарио Р., Маркон Л., Сколари Н., Буено Б.В., Демин К.А., Амстиславская Т.Г., Стрекалова Т., Соарес М.К., де Абреу М.С., Калуев А.В. Pro-social and anxiolytic-like behavior following a single 24-h exposure to 17β-estradiol in adult male zebrafish Neuroscience Letters, т. 747, 16 Марта 2021, Epub 135591 (год публикации - 2021).

16. Фонтана Б.Д., Мюллер Т.Е., Клил М., де Абреу М.С., Нортон В.Х.Ж, Демин К.А, Амстиславская Т.Г., Петерсен Е.В., Калуев А.В., Паркер М.О., Роземберг Д.Б. Using zebrafish (Danio rerio) models to understand the critical role of social interactions in mental health and wellbeing Progress in Neurobiology, Epub online 10 January 2021, 101993 (год публикации - 2021).


Возможность практического использования результатов
В данном исследовании предложены специфические биомаркеры, интегрирующие стресс и нейровоспалительные процессы, способствующие формированию аффективной патологии у позвоночных, которые могут быть использованы для дальнейшей разработки, а также преклинического и клинического тестирования про- и анти-депрессантных, -тревожных и -воспалительных препаратов. Также, разработанный метод трансляции данных транскриптома между видами, для исследования эволюционно-консервативных черт патогенеза, планируется к использованию в последующих проектах лаборатории, для определения консервативных мишеней других гетерогенных нейропсихических заболеваний