КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер 19-15-00163

НазваниеИсследование роли микроРНК в структурно-функциональном созревании пейсмекера сердца, а также возможности репрограммирования клеток сердца с помощью микроРНК с целью коррекции нарушений ритма

РуководительАбрамочкин Денис Валерьевич, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московский государственный университет имени M.В.Ломоносова», г Москва

Период выполнения при поддержке РНФ

2019 г. - 2021 г.

Конкурс№35 - Конкурс 2019 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами».

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины, 05-104 - Физиология

Ключевые словамикроРНК, пейсмекер, сино-атриальный узел, экспрессия, постнатальный онтогенез, аритмии, фибрилляция предсердий, ионные токи, потенциал действия

Код ГРНТИ34.39.29

СтатусУспешно завершен

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
МикроРНК являются малыми молекулами, которые специфически ингибируют экспрессию генов путем так называемой РНК-интерференции или «сайленсинга». Исследования генома человека показали, что существует порядка 2000 микроРНК, часть из которых является тканеспецифическими. Установлено, что микроРНК выполняют регуляторную роль в целом ряде биологических процессов, например они важны для эмбрионального развития (Bartel, 2009). Показано также, что микроРНК играют важную роль в физиологии и патофизиологии сердечнососудистой системы; выявлена их связь с формированием ряда патологий сердца и сосудов. МикроРНК рассматриваются также как маркеры сердечнососудистых заболеваний (Condorelli et al., 2014; van Rooij et al., 2008a; Wang et al., 2014b). Хорошо известно, что так называемые транскрипционные факторы являются внутриклеточными молекулами регулирующими экспрессию генов. Транскрипционные факторы (ТФ) контролируют так называемый «электрофизиологический фенотип» клеток сердца – кардиомиоцитов: под управлением ТФ в кардиомиоцитах экспрессируются гены определенных ионных каналов и переносчиков, в результате чего клетки сердца приобретают биоэлектрическую активность, свойственную рабочему миокарду, либо миокарду пейсмекера (ритмоводителя). В настоящее время показано, что ТФ и микроРНК тесно взаимодействуют. Возможно, что экспрессия генов ТФ и ионных каналов/переносчиков находятся под контролем микроРНК (Bucchi et al., 2006; Hu et al., 2014; Marban and Cingolani, 2015; Potapova et al., 2004). Благодаря нескольким пионерским работам, в том числе группы под руководством Г.Добржинской (D'Souza et al., 2017) показано, что существуют микроРНК, специфически экспрессируемые в различных отделах сердца, в том числе в пейсмекерном миокарде синоатриального узла, а также то, что эти специфические микроРНК влияют на его автоматическую активность. Более того, на основе аналитических биоинформационных исследований сделано предположение о том, какие именно микроРНК могут обладать регуляторной активностью в пейсмекерном и рабочем миокарде. Эти предположения требуют экспериментального подтверждения: практически полностью отсутствуют сведения о влиянии in vivo и конкретных механизмах действия микроРНК на пейсмекерный и рабочий миокард сердца, сведения об их участии в симпатическом и парасимпатическом контроле работы миокарда. В данном проекте планируется достичь две цели, одна из которых носит фундаментальный характер, а вторая в большей степени является прикладной. Первая цель заключается в исследовании роли микроРНК в формировании структуры и преобразовании электрофизиологических свойств ритмоводителя сердца в ходе постнатального онтогенеза, а также в поиске конкретных ионных механизмов, посредством которых микроРНК оказывают действие на электрофизиологические свойства миокарда. Вторая цель состоит в выяснении возможности воздействия на пейсмекерную активность синоатриального узла при системном введении микроРНК взрослым животным, а также их воздействия на аритмогенные свойства миокардиальной ткани легочных вен. Возможность достижения целей проекта рассматривается авторами как высокая, поскольку существует определенный перечень микроРНК, которые как ожидается будут обладать эффективностью в пейсмекерном и рабочем миокарде. Всего в работе будет использовано шесть таких микроРНК кандидатов. Известно, что три из отобранных микроРНК могут взаимодействовать с продуктами генов, определяющих пейсмекерный характер биоэлектрической активности кардиомиоцитов, а другие три микроРНК – с продуктами генов, обуславливающих характер биоэлектрической активности, свойственной рабочим кардиомиоцитам. Предполагается, что первая группа микроРНК может обладать способностью подавлять эктопическую активность в аритмогенном миокарде. Таким образом, реализация проекта позволит определить возможность практического применения новых эндогенных регуляторов работы сердца при коррекции работы пейсмекерного миокарда, а также коррекции биоэлектрической активности, способствующей возникновению нарушений ритма сердца. Данное исследование будет проведено с использованием нескольких видов лабораторных животных, что позволит максимально подробно изучить разные аспекты ионных механизмов действия микроРНК. В работе будет применен целый ряд методов исследования, как экспериментальных электрофизиологических, так и аналитических. Для решения поставленных в проекте задач будут проведены in vivo эксперименты на интактных животных, ex vivo эксперименты с тканевыми препаратами миокарда и изолированными клетками - кардиомиоцитами. Ранее подобных комплексных исследований не проводилось.

Ожидаемые результаты
В настоящее время регуляторная роль микроРНК интенсивно исследуется. Преобладающее количество работ направлено на изучение роли данных соединений в регуляции функционирования и экспрессии генов в патологически измененных клетках злокачественных опухолей, хотя показано, что микроРНК участвуют в формировании некоторых патологий сердечнососудистой системы. Данный проект направлен на исследование эффектов и механизмов действия нового класса регуляторных соединений - микроРНК в пейсмекерном и рабочем миокарде сердца, будет предпринята попытка выявления ранее не изученного способа контроля автоматической активности в тканях сердца. Также в проекте будет исследована возможность коррекции патологий работы сердца, связанных с нарушением способности к автоматии естественного пейсмекера (синоатриального узла), либо с усилением патологической автоматической активности во внепейсмекерных структурах сердца (миокарде легочных вен). Исследование роли микроРНК в регуляции работы биоэлектрической активности пейсмекерного и рабочего миокарда будет проводится на органном, тканевом, клеточном уровнях. В ходе выполнения проекта будут получены следующие принципиально новые результаты. 1. Будут получены данные о способности кардиоспецифических ранее отобранных микроРНК регулировать тканевое и биоэлектрическое формирование синоатриального узла (САУ) в ходе постнатального онтогенеза. Будут получены сведения о влиянии микроРНК с предполагаемой активностью на электрофизиологические свойства (конфигурация потенциалов действия, уровень потенциала покоя) пейсмекерного миокарда САУ и рабочего миокарда предсердий взрослых крыс, а также крысят возрастом 1, 7 и 21 день. Будут получены данные об эффективности шести микроРНК - miR-153, miR-198, miR-512-5p и miR-133a-3p, miR-429, miR-486-3p. Также будут получены данные о влиянии микроРНК на гистологические характеристики САУ и рабочего миокарда, в частности, на распределение белков щелевых контактов Сх30.8, Сх45 или Сх43, которые являются основными маркерами пейсмекерного или рабочего миокарда, соответственно. 2. С помощью техники пэтч-кламп в конфигурации whole-cell будет установлено, действительно ли экзогенные/внеклеточные микроРНК способны влиять на свои конечные мишени (ионные каналы) в пейсмекерных и рабочих предсердных кардиомиоцитах крысы или кролика. Эти мишени будут определены для каждого из 6 видов отобранных микроРНК. 3. Будут получены сведения о способности микроРНК модифицировать пейсмекерную активность синоатриального узла и биоэлектрическую активность рабочего миокарда при системном введении. Для решения данной задачи будет использована методика регистрации ЭКГ in vivo, а также техника микроэлектродных отведений для регистрации ПД в миокардиальных препаратах, изолируемых после эвтаназии. Будут получены данные о влиянии микроРНК на электрофизиологические характеристики in vivo с использованием минимум двух видов лабораторных животных, в том числе мини-свиней, так как их частота сердечных сокращений и другие электрофизиологические параметры максимально близки к таковым у человека. Будут получены данные при системном введении микроРНК на основе системы доставки на частоту сердечных сокращений, параметры ЭКГ, потенциалы действия в изолированных препаратах САУ и предсердий. Кроме того, в данной части работы впервые будет исследована способность микроРНК влиять на чувствительность САУ к вегетативной регуляции (чувствительность к симпатическим и парасимпатическим воздействиям). 4. Будут получены данные о способности экзогенных микроРНК влиять на проаритмические свойства миокарда, обладающего эктопической активностью (миокардиальной обкладки легочных вен). Такие результаты будут получены впервые. Известно, что миокард легочных вен является аритмогенный субстратом, благодаря тому, что у взрослых животных эта ткань приобретает способность спонтанно генерировать потенциалы действия, то есть приобретает свойства патологического эктопического пейсмекера, и в то же самое время, теряет электрофизиологические свойства рабочего миокарда (Haissaguerre M., Jais P., Shah D.C. N. Engl. J. Med. 339 : 659–666. 1998). Эти сведения позволяют предположить, что микроРНК, влияющие на экспрессию генов ионных каналов и транспортеров, отвечающих за пейсмекерный фенотип, будут оказывать действие на патологическую автоматию в легочных венах. Влияние микроРНК на биоэлектрическую активность легочных вен будет оцениваться в изолированных препаратах с помощью микроэлектродной техники с использованием двух видов животных: крыс и мышей С57bl6/CBA. Данный гибрид мышей будет использован, так как в нормальных условиях у взрослых, внешне здоровых особей ткань предсердий демонстрирует высокочастотную автоматическую активность. В серии экспериментов с миокардиальными препаратами крысы эффекты микроРНК будут выявляться на фоне адренергической стимуляции. Эти эксперименты позволят получить данные о потенциальной про- или антиаритмогенной активности экзогенных микроРНК. На основе работ по проекту планируется подготовка 10 публикаций в научных журналах, индексируемых в WoS и Scopus.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
В ходе работ по Проекту в 2019 году был подобран оптимальный способ системного введения микроРНК крысам – в комплексе с кальций-фосфатными наночастицами. Благодаря этому были получены данные о влиянии внутривенного введения микроРНК miR-512, miR-133a-3p, miR-429, miR-486-3p и miR-1-3p в дозе 1 мг/кг на ЧСС и параметры ЭКГ у взрослых, новорожденных и 21-дневных крыс, а также на параметры электрической активности в препаратах миокарда этих крыс и экспрессию коннексинов Сх43, Сх40 и Сх45. Показано, что miR-486-3p вызывает изменение ЧСС у 21-дневных крысят. Кроме того, эта микроРНК вызывает удлинение потенциалов действия в предсердном миокарде взрослых крыс и крыс возрастом 21 день. Введение miR-1-3p вызывало замедление сердечного ритма у взрослых крыс, а miR-133a-3p – у новорожденных крысят, подавляя свойственное для данного возраста ускорение ЧСС, обусловленное развитием организма. С другой стороны miR-1-3p удлиняла QT-интервал у новорожденных крысят. Среди трех типов исследованных коннексинов только один из них, Сх40, оказался чувствительным к воздействию одного вида микроРНК, miR-429, которая увеличивала его экспрессию. Также в 2019 году были получены данные о влиянии шести микроРНК (miR-512, miR-133a-3p, miR-429, miR-486-3p и miR-1-3p, miR-153) на параметры потенциалов действия в изолированных многоклеточных препаратах рабочего предсердного миокарда и синоатриального узла крыс 3-х возрастов в течение 6 часов после введения трансфицирующей смеси микроРНК с липофектамином в препарат путем микроинъекции. Установлено, что miR-133a-3p и miR-429 вызывают увеличение длительности потенциалов действия в рабочем миокарде крыс разных возрастов. В изолированных препаратах синоатриального узла изменение частоты генерации спонтанных потенциалов действия вызывали miR-429 и miR-486-3p.

Публикации

1. Кузьмин В.С., Иванова А.Д., Пустовит К.Б., Абрамочкин Д.В. Изменения электрофизиологических характеристик рабочего предсердного миокарда крысы при его липотрансфекции микроРНК miR-1-3p, miR-153-3р и miR-133a-3p Вестник Московского университета. Серия 16. Биология, - (год публикации - 2020)

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
В соответствии с планом проекта, в 2020 году проведено исследование ионных механизмов действия miR-486-3p, miR-1, miR-133a-3p на электрическую активность кардиомиоцитов, а также эффектов этих микроРНК в легочных венах. Получены сведения о способности miR-486-3p, miR-133a-3p снижать калиевый ток аномального выпрямления (IK1), и усиливать кальциевый ток L-типа (ICaL) при липотрансфекции в энзиматически изолированных рабочих кардиомиоцитах сердца крысы, а также о способности miR-1 оказывать обратный эффект в отношении IK1. Впервые исследовано влияние микроРНК на электрофизиологические свойства пейсмекерных кардиомиоцитов межвенной области правого предсердия крысы. Выявлена способность микроРНК miR-486-3p в течение суток после ее внутривенного введения в комплексе с наночастицами подавлять ток IK1, увеличивая при этом ICaL и транзиторный калиевый ток Ito в пейсмекерных кардиомиоцитах, таким образом, впервые продемонстрированы электрофизиологические механизмы модуляции ритма сердца экзогенными микроРНК. В 2020 году впервые исследована способность экзогенных микроРНК модулировать эктопическую проаритмическую активность в тканевых препаратах миокардиальной такни легочных вен. Показано, что все три микроРНК (miR-486-3p, miR-1, miR-133a-3p) в той или иной степени оказывают влияние на электрофизиологические параметры спонтанной активности, вызываемой норадреналином в миокарде легочных вен крыс. Также установлено, что в миокардиальной ткани легочных вен мышей B6CBAF1, демонстрирующей значительную предрасположенность к эктопической и триггерной активности, все три микроРНК изменяют характер этой активности. Показано, что miR-1 через сутки после внутривенного введения в легочных менах мышей предотвращает проаритмическую триггерную активность, подавляя постдеполяризации и способствуя поддержанию стабильного уровня потенциала покоя. МикроРНК miR-133a-3p и, возможно, miR-486-3p, оказывают противоположное действие. Таким образом, впервые продемонстрирована возможность подавления проаритмических явлений с помощью экзогенных микроРНК.

Публикации

1. Иванова А.Д., Филатова Т.С., Абрамочкин Д.В., Эткинсон Э., Добржински Г., Кокаева З.Г., Розенштраух Л.В., Кузьмин В.С. Attenuation of inward rectifier potassium current contributes to the α1-adrenergic receptors induced proarrhythmicity in the caval vein myocardium Acta Physiologica, - (год публикации - 2020)

2. Кузьмин В.С., Потехина В.М., Одношивкина Ю.Г., Челомбитько М.А., Федоров А.В., Аверина О.А., Бородков А.С., Шевцова А.А., Ловать М.Л., Петров А.М. Proarrhythmic atrial ectopy associated with heart sympathetic innervation dysfunctions is specific for murine B6CBAF1 hybrid strain Life Sciences, - (год публикации - 2020)

3. Петкова М., Эткинсон А.Д., Янни Д., Стьюарт Л., Амиху А.Д., Иванова А.Д., Пустовит К.Б., Джерагти К., Фэзер Э., Ли Н., Жанг Ю., Оушенди Д., Пэрдэ Ф., Молинар П., Д'Суза А., Фёдоров В.В., Добржински Г. Identification of key small non-coding microRNAs controlling pacemaker mechanisms in the human sinus node Journal of the American Heart Association, V.9 : e016590 (год публикации - 2020) https://doi.org/10.1161/JAHA.120.016590

4. Стецик Д.Э.В., Кутюрье К.С., Абрамочкин Д.В., Холл Д., Эррант-Хоувелл Э., Кабли К.Л., Локманн С., Лог К., Трублад Л., Суоллинг К., Пинард Д., Вогт А. Cardiophysiological responses of the air-breathing Alaska blackfish to cold acclimation and chronic hypoxic submergence at 5°C Journal of Experimental Biology, V. 223 : jeb225730 (год публикации - 2020) https://doi.org/10.1242/jeb.225730

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
В 2021 году основные результаты были получены в ходе исследования воздействия in vivo трансфекции микроРНК miR-1 и miR-486 на электрическую активность сердца мини-свиней на клеточном, тканевом и организменном уровнях организации, а также изучения эффектов данных микроРНК в культуре неонатальных кардиомиоцитов крысы. На первом этапе работы были изучены характеристики минисвиньи как объекта электрофизиологического исследования, подтверждена высокая степень сходства с человеком как по типу нервной регуляции сердечно-сосудистой системы, так и по параметрам ЭКГ, конфигурации потенциалов действия и набору ионных токов в кардиомиоцитах. Для изучения действия miR-1 и miR-486 на электрическую активность сердца минисвиней животных подвергали in vivo трансфекции посредством внутривенного введения плазмид, экспрессирующих предшественники, соответственно, miR-1 или miR-486 в смеси с фосфаткальциевыми частицами. In vivo трансфекция miR-1 не приводила к значимым изменениям электрофизиологических параметров миокарда и ионных токов. В то же время, было установлено, что трансфекция miR-486 снижает выраженность парасимпатической регуляции сердечного ритма у минисвиней, при этом данный эффект не связан с подавлением чувствительности кардиомиоцитов к холинергическим воздействиям. Также была показана способность miR-486 снижать способность синоатриального и атриовентрикулярного узлов к автоматической активности и проведению возбуждения, а также ускорять реполяризацию в желудочковом миокарде минисвиней. Была налажена методика получения изолированных желудочковых миоцитов минисвиней и с помощью метода пэтч-кламп в значительной степени раскрыт ионный механизм последнего эффекта. Он заключается в усилении калиевого тока входящего выпрямления IK1, а также быстрого и медленного токов задержанного выпрямления IKr и IKs, в купе с подавлением кальциевого тока ICaL, которое также может обуславливать снижение автоматической способности и торможение проведения в узлах автоматии. Наконец, методом qPCR было показано снижение экспрессии гена канала HCN4, опосредующего «пейсмекерный» ток If (“funny” current) в предсердиях минисвиней после in vivo трансфекции miR-486. В экспериментах на культуре неонатальных кардиомиоцитов крысы была обнаружена способность miR-486 подавлять транзиторный кальциевый ток ICaT, характерный для незрелых и пейсмекерных кардиомиоцитов. Полученные результаты позволяют заключить, что функции miR-486 в сердце зависят от вида и возраста животного. В отличие от кардиомиоцитов взрослых крыс, эта микроРНК действует как «антипейсмекерная», стимулируя проявления рабочего электрофизиологического фенотипа в неонатальных миоцитах крысы, а также подавляя выраженность токов и экспрессию каналов, обуславливающих пейсмекерную функцию в кардиомиоцитах минисвиней, наиболее близкого к человеку виду доступных экспериментальных животных. Полученные данные позволяют предложить miR-486 как потенциальный инструмент для ингибирования эктопической автоматической активности в сердце.

Публикации

1. Абрамочкин Д.В., Кузьмин В.С., Мачков В., Каменский А.А., Ванг Т. The snake heart pacemaker is localized near the sinoatrial valve The Journal of experimental biology, 224(16):jeb242778 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.1242/jeb.242778

2. Кузьмин В.С., Иванова А.Д., Потехина В.М., Самойлова Д.В., Ушенин К.С., Швецова А.А., Петров А.М. The susceptibility of the rat pulmonary and caval vein myocardium to the catecholamine-induced ectopy changes oppositely in postnatal development The Journal of physiology, V.599(11):2803-2821 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.1113/JP280485

3. Кузьмин В.С., Иванова А.Д., Филатова Т.С.,Пустовит К.Б., Кобылина А.А., Эткинсон Э.Д., Петкова М., Воронков Ю.И., Абрамочкин Д.В., Добржински Г. Micro-RNA 133a-3p induces repolarization abnormalities in atrial myocardium and modulates ventricular electrophysiology affecting I Ca,L and Ito currents European Journal of Pharmacology, V.908: 174369 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.1016/j.ejphar.2021.174369

4. Кузьмин В.С., Кобылина А.А., Пустовит К.Б., Иванова А.Д., Абрамочкин Д.В. микроРНК miR-133a-3p усиливает адренергическую проаритмическую активность в миокарде лёгочных вен крыс, повышая внутриклеточную концентрацию цАМФ Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, - (год публикации - 2022)

Возможность практического использования результатов
не указано