КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 19-15-00244

НазваниеИЗУЧЕНИЕ БИОСОВМЕСТИМОСТИ ОКСИДА ГРАФЕНА С КЛЕТКАМИ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ В КОНТЕКСТЕ ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ В БИОМЕДИЦИНЕ

РуководительЗаморина Светлана Анатольевна, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регионФедеральное государственное бюджетное учреждение науки Пермский федеральный исследовательский центр Уральского отделения Российской академии наук, Пермский край

Года выполнения при поддержке РНФ 2019 - 2021 

КонкурсКонкурс 2019 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины, 05-108 - Иммунология

Ключевые словаОксид графена, наночастицы, адресная доставка лекарственных средств, тераностика, биосовместимость, функционализация поверхности наночастиц, клетки иммунной системы, биомедицина

Код ГРНТИ34.43.35


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
Все более широкое применение препаратов на основе оксида графена в in vivo терапии и диагностике диктует необходимость всесторонней оценки его биосовместимости. Критически важным является изучение воздействия оксида графена и его производных на клетки иммунной системы. С одной стороны, это обусловлено тем, что при введении в организм препаратов на основе графена контакт между ними и клетками врожденного и адаптивного иммунитета неизбежен, и он в любом случае будет иметь место в кровотоке либо лимфоидных органах. Негативные последствия такого контакта, такие как стимуляция провоспалительной активности, клеточной гибели или анергии иммунных клеток могут стать причиной возникновения патологических состояний. С другой стороны, способность оксида графена изменять активность иммунокомпетентных клеток может быть использована (и используется) как средство повышения эффективности вакцин (адъювантный эффект), противоопухолевых препаратов (цитотоксичность), и препаратов с антимикробным эффектом (активация макрофагов и клеток-киллеров). Таким образом, целью настоящего проекта является систематическая оценка эффектов клинически значимых модификаций оксида графена на ключевые субпопуляции клеток врожденного иммунитета (макрофаги, дендритные клетки, NK-клетки, нейтрофилы) и адаптивного иммунитета (Т- и В-клетки), при этом скрининговые тесты, оценивающие дифференцировку и функциональную активность исследуемых клеток будут дополняться динамической визуализацией в системе Cell-IQ. Под клинически значимыми модификациями оксида графена мы подразумеваем оксид графена (ОГ) с поверхностью модифицированной полиэтиленгликолем (ПЭГ) и полиакриловой кислотой (ПАК). Выбор таких объектов исследования обусловлен тем, что в ряде исследований была доказана их эффективность как биосовместимого покрытия нанопластин ОГ. В то же время, данные об их воздействии на иммунные клетки отрывочны (особенно в отношении ОГ-ПАК), а зачастую и противоречивы, причем противоречия касаются ряда клинически значимых аспектов: стимулирование/подавление презентации антигена, влияние на поляризацию иммунного ответа, наличие или отсутствие цитотоксических эффектов в отношении ряда иммунных клеток. Под биосовместимостью подразумевается оценка жизнеспособности, процессов апоптоза, функциональной активности и дифференцировки клеток иммунной системы. По итогам работы мы планируем получить новую, исчерпывающую информацию о взаимоотношениях модифицированных форм оксида графена с важнейшими звеньями иммунной системы. Фундаментальный аспект проекта связан с расширением наших представлений о взаимодействии наночастиц с клетками человека, так как в процессе эволюции человек не взаимодействовал с графеном. Прикладной аспект связан с прогнозированием эффективности и безопасности терапевтических и вакцинных препаратов на основе графена, при создании новых технологий адресной доставки лекарственных средств, и систем визуализации тканей (в особенности лимфоидной). Таким образом, настоящее исследование находится в рамках заявленной стратегии перехода к высокотехнологичному здравоохранению.

Ожидаемые результаты
По итогам реализации проекта будут получены данные о воздействии оксида графена на ключевые субпопуляции клеток врожденного и адаптивного иммунитета, как эффекторные, так и регуляторные. Будут проведена оценка влияния не только оксида графена, но и его производных форм, поверхность которых модифицирована полимерами, призванными улучшить его биосовместимость и широко применяемыми в биомедицине (полиэтиленгликолем и полиакриловой кислотой). Результатом работы станет систематическая сравнительная оценка дозозависимых эффектов препаратов оксида графена на жизнеспособность, морфологию (экспрессию поверхностных молекул) и функциональную активность (экспрессию ключевых генов, поляризацию иммунного ответа, продукцию цитокинов, активных форм кислорода) клеток иммунной системы человека. В чем состоит значимость этих результатов? Оксид графена является перспективным диагностическим и терапевтическим агентом, однако его практическое применение тормозится ввиду недостатка систематических сведений о его биосовместимости, а в частности воздействия на иммунную систему. Наш проект направлен на комплексное исследование этого воздействия. Мы будем использовать препараты оксида графена, покрытые перспективными биосовместимыми биополимерами. Именно в таком виде оксид графена используются в адресной доставке лекарственных средств, при создании иммуномодуляторов и терапевтических препаратов. Два основных вопроса, на которые призван дать ответ наш проект: безопасен ли оксид графена для иммунокомпетентных клеток? какие из обнаруженных эффектов оксида графена на иммунные клетки могут быть использованы для создания перспективных биомедицинских препаратов? Эффекты оксида графена на клетки врожденного, адаптивного иммунитета и поляризацию иммунного ответа могут быть использованы при изготовлении безопасных иммуномодуляторов, адъювантов и лекарственных средств на основе оксида графена.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2019 году
В первый год проекта осуществлен синтез нанопластин оксида графена (ОГ) различного размера и проведена их химическая модификация полиэтиленгликолем (ПЭГ) и полиакриловой кислотой (ПАК) с последующей оценкой свойств синтезированных нанопластин (размеры, дзета-потенциал, подтверждения связывания полимеров с поверхностью оксида графена, коллоидная стабильность в культуральных средах). Проведенные исследования пегилированных образцов ОГ показали, что процесс химической пришивки прошел успешно, ароматическая структура ОГ не изменилась. При этом средний размер пластин пегилированного ОГ по сравнению с исходным, заявленным производителем 1-5 мкм, снизился до 569±14 нм. По предварительным оценкам, количество покрывающего ОГ ПЭГа составляет порядка 19-20%. Проведенные исследования состава ОГ-ПАК методом ИК-спектрометрии выявили очень слабые рефлексные полосы, характеризующие наличие функциональных групп ПАК. Таким образом, выбранные условия полимеризации АК в присутствии ОГ не позволили модифицировать последний. Для использования нанопластин ОГ в исследованиях на клетках необходимо удалить эндотоксин, концентрацию которого определяют при помощи ЛАЛ-теста. Этот тест основан на измерении поглощения реакционной смеси при 405 нм. Ввиду широкого спектра поглощения ОГ в видимом диапазоне, нанопластины сами по себе влияют на результат определения эндотоксина. Поскольку эндотоксин может неспецифически сорбироваться на поверхности нанопластин, необходимо получить референсный препарат ОГ-ПЭГ, свободный от эндотоксина. Для этого мы провели трехкратное автоклавирование ОГ-ПЭГ (120 °C, 20 мин) [Lahiani et al. DOI 10.1002/jat.3477]. Обработка гидроксидом натрия в течение 3х суток является наиболее технологически простым методом удаления эндотоксина, поскольку многократное осаждение тритоном -114 приводит к потерям части ОГ-ПЭГ. Уровень эндотоксина в препаратах ОГ-ПЭГ был менее 0,5 МЕ/мл. Исследована сорбция белков сыворотки крови на нанопластинах ОГ, нативных и модифицированных ПЭГ и ПАК и проведено количественное сопоставление их белковых корон. Белки сыворотки крови более интенсивно сорбировались на ОГ-ПЭГ, что было подтверждено количественным анализом белка по Бредфорд. Некоторое увеличение сорбции белков на поверхности наночастиц, покрытых низкомолекулярным ПЭГ, наблюдалось в работе [Petry, R. Et al. DOI: 10.1016/j.msec.2019.110080, fig. 6.]. Мы объясняем повышенную сорбцию белка снижением размеров нанопластин после функционализации ПЭГ, которое привело к увеличению удельной площади поверхности нанопластин. Данные количественного анализа сорбции белков сыворотки и IgG подтвердили данные электрофореза. Полученные наночастица ОГ и ОГ-ПЭГ исследовали на предмет их цитотоксичности на уровне клеток иммунной системы. В качестве объектов использовали мононуклеарные клетки и нейтрофилы периферической крови здоровых доноров. В работе исследовали эффекты ОГ и ОГ-ПЭГ в различных концентрациях (80 мкг/мл; 40 мкг/мл; 20 мкг/мл; 10 мкг/мл; 5 мкг/мл; 2,5 мкг/мл; 1,25 мкг/мл; 0, 625 мкг/мл; 0,312 мкг/мл; 0,156 мкг/мл; 0 мкг/мл (контроль)). Установлено, что на уровне мононуклеарных клеток (моноциты+лимфоциты) процент живых клеток в культурах с разными концентрациями графена (ОГ-ПЭГ) был от 91,5 до 96,5, и достоверного цитотоксического эффекта наночастиц не зафиксировано. В то же время, на уровне нейтрофилов процент живых клеток в культурах с разными концентрациями графена составлял от 73% до 78%, что свидетельствует о цитотоксическом эффекте наночастиц ОГ-ПЭГ на уровне нейтрофилов. Была проведена серия экспериментов по изучению влияния ОГ-ПЭГ на продукцию активных форм кислорода (АФК) суммарным пулом лейкоцитов периферической крови. Анализ кинетики хемилюминесценции нейтрофилов выявил следующие закономерности: максимальная интенсивность активированной нанопластинами ОГ-ПЭГ (5 мкг/мл и 1,25 мкг/мл) хемилюминесценции нейтрофилов в 3 раза превышала значение контрольных проб. Таким образом, ОГ-ПЭГ оказывал стимулирующий эффект на продукцию АФК общим пулом лейкоцитов, и этот эффект был достоверно выше, чем самостоятельный эффект ПЭГ и зимозана в соответствующих концентрациях. Учитывая тот факт, что наночастицы ОГ могут поглощаться клетками иммунной системы (моноциты, нейтрофилы периферической крови), мы провели серию пилотных экспериментов по оценке фагоцитарной активности клеток в отношении ОГ-ПЭГ в сравнении с нефункционализированным ОГ. Показано, что по сравнению с объектами фагоцитоза, имеющими биологическое происхождение, фагоцитоз частиц ОГ и ОГ-ПЭГ снижен, причем, функционализированный ОГ поглощается фагоцитами менее охотно, чем нефункционализированный. Была проведена серия пилотных экспериментов по изучению влияния разных модификаций ОГ на дифференцировку миелоидных супрессорных клеток (MDSC) в экспериментальной модели in vitro. Установлено, что присутствие ОГ-ПЭГ приводило к повышению процента M-MDSC в культурах (5 и 10 мкг/мл), и одновременно снижало уровень G-MDSC (5 мкг/мл). Таким образом, показано, что субпопуляции MDSC по-разному реагируют на наночастицы ОГ, при этом клетки гранулоцитарного ряда более чувствительны. В задачи первого года исследований входило также визуализация действия частиц ОГ в системе Cell-IQ. При анализе клеточной массы культуры клеток линии Jurkat было показано, что количество полиплоидных клеток на момент образования последнего полиплоида ниже при сокультивировании с наночастицами ОГ, по сравнению с культивацией без них. Анализ нормальных мононуклеарных клеток показал, что их число увеличивается в обеих моделях культивирования, без статистического различия между ними в конце эксперимента.

 

Публикации

1. - В тренде биомедицины Наука Урала, ноябрь, 2019, N 22 (год публикации - ).


Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Все исследования по гранту во второй год были поделены на два блока – работа непосредственно с наночастицами оксида графена (GO), и работа по изучению влияния наночастиц GO на клетки иммунной системы. Была проведена функционализация наночастиц GO как обычным полиэтиленгликолем (PEG), так и разветвленным (8-arm). Это связано с тем, что данная модификация PEG может обеспечить лучшую коллоидную стабильность нанопластин, а также снизить количество белка, которое сорбируется на их поверхности. Кроме этого, в работу включили наночастицы как большого (1-5 мкм, L), так и малого размера (0,1-0,5 мкм, S), как и планировали ранее. Таким образом, в исследованиях in vitro применяли наночастицы GO-L, GO-PEG-S, GO-PEGarm-S, GO-PEG-L, GO-PEGarm-L. Проведенные исследования пегилированных образцов GO показали, что процесс химической пришивки прошел успешно, ароматическая структура GO не изменилась. Проведенные синтезы по модификации GO полиакриловой кислотой (ПАК) не дали положительных результатов. В целом, мы считаем малоперспективным продолжение синтезов по модификации GO полиакриловой кислотой, в связи с чем необходимо большее внимание уделить исследованию процесса модифицирования поверхности GO линейным и разветвленным полиэтиленгликолем и изучению их свойств. При изучении белковой короны наночастиц, полученных в 2020 г., показано, что белки сыворотки крови более интенсивно сорбируются на GO меньшего размера, что объясняется большей удельной площадью их поверхности. Уровень эндотоксина в препаратах GO-PEG (2020) был снижен до менее чем 0,1 ME/мл, в сравнении с уровнем прошлого года (0,5 ME/мл). При изучении влияния наночастиц GO на показатели функциональной активности нейтрофилов установлено следующее: частицы GO способны активно поглощаться нейтрофилами, однако пегилирование предотвращает их интернализацию клетками. При оценке влияния GO и GO-PEG на спонтанную и стимулированную продукцию активных форм кислорода (АФК) обнаружено, что внесение частиц GO и GO-PEG (25 и 50 мкг/мл) в суспензию клеток снижало показатели люминол-зависимой хемилюминесценции. В целом, покрытие частиц ОГ полиэтиленгликолем не влияет на синтез АФК клетками. Чтобы исключить самостоятельный эффект тушения люминесценции GO, мы провели эксперименты в бесклеточной системе, в которых тушения люминесценции не обнаружено. Таким образом, подавление люминесценции в клеточной системе связано с другими механизмами действия наночастиц, основанными на взаимодействии с клетками. При изучении продукции АФК под воздействием более низких концентраций GO (фармакологический спектр) установлено, что наночастицы GO-PEG (2,5 и 5 мкг/мл) угнетали продукцию АФК, в то время как наночастицы GO не оказывали достоверного эффекта. Установлено, что все используемые модификации наночастиц GO и GO-PEG индуцировали апоптоз нейтрофилов (5 и 25 мкг/мл), за одним исключением (GO-PEGarm-S, 5 мкг/мл). Таким образом, покрытие частиц разветвленным полиэтиленгликолем способно отменять апоптоз нейтрофилов. При изучении влияния наночастиц GO на показатели функциональной активности клеток моноцитарно-макрофагального ряда установлено, что наночастицы не влияют на жизнеспособность моноцитов периферической крови человека. При изучении процессов поглощения наночастиц GO моноцитами, показано, что частицы активно адгезировали на моноцитах и поглощались этими клетками, процент фагоцитирующих клеток был прямо зависим от размера наночастиц и их концентрации. Установлено, что все исследуемые наночастицы GO-PEG не оказывали значимого эффекта на продукцию АФК изолированными моноцитами, (светосумму хемилюминесценции за 30 минут), однако большие частицы в высокой концентрации (GO-PEG-L; 25 мкг/мл) стимулировали продукцию АФК. Интересно, что эффект этих частиц на суммарный уровень продукции АФК моноцитами на 90 минуте был противоположным: наблюдалось снижение показателей хемилюминесценции в пробах с GO-PEG-L (25 мкг/мл). Отдельной серией экспериментов мы оценивали влияние наночастиц GO (образцы 2019 г.) на зрелые клетки моноцитарно-макрофагального ряда. В частности, было изучено влияние GO-PEG на дифференцировку дендритных клеток (ДК) в культуре. Показано, что наночастицы GO-PEG-L снижают процентное содержание ДК в долговременной культуре мононуклеарных клеток (2,5; 5 мкг/мл). В аналогичной системе длительного культивирования оценивали влияние наночастиц GO на конверсию моноцитов в макрофаги фенотипа M1 и M2 в условиях направленной индукции в соответствующий фенотип. Показано, что GO-PEG-L индуцировали дифференцировку в M1, отмечена прямая зависимость от концентрации. Показано, что наночастицы GO-PEG-S, GO-PEGarm-S, GO-PEG-L, GO-PEGarm-L не оказывали достоверного влияния на показатели раннего и позднего апоптоза NK и NKT клеток. Также не выявлено статистически достоверных эффектов наночастиц GO на количество NK и NKT клеток в культурах, при этом размер, концентрация и тип функционализации не имел значения. При анализе влияния частиц оксида графена на культуру нормальных мононуклеарных клеток в системе Cell-IQ, наблюдалась повышенная вариативность показателей прироста клеточной массы, что обусловлено гетерогенностью клеточной культуры. В целом, прирост клеточной массы в культурах мононуклеарных клеток при краткосрочном сокультивировании с образцами GO-PEG (24 часа) был сопоставим с аналогичными параметрами контрольной группы. Жизнеспособность и динамика клеточной массы нормальных иммунокомпетентных клеток (мононуклеарные клетки) не зависит от концентрации наночастиц GO и типа функционализации поверхности. При увеличении концентрации наночастиц GO при сокультивировании с нормальными иммунокомпетентными клетками, наблюдалось увеличение флуоресценции в канале FL4, что вероятно, обусловлено присутствием моноцитарных клеток, которые активно фагоцитируют частицы GO, что согласуется с нашими данными, полученными методом проточной цитометрии. Для понимания процессов, происходящих в клетках, эффекты наночастиц оценивали на патологически измененной линии иммунокомпетентных клеток – Jurcat. Было установлено, что наночастицы GO-PEG (2020 г.) оказывали угнетающее воздействие при краткосрочном культивировании на патологически измененные иммунокомпетентные клетки, что выражалось, с одной стороны, увеличением относительного числа мертвых клеток, а с другой стороны отсутствием прироста клеточной массы относительно контрольной группы. Негативные эффекты, регистрируемые при сокультивировании Jurkat T-клеток с образцами графена, зависели от концентрации наночастиц, но не зависели от типа образца. Таким образом, по итогам второго года получены и охарактеризованы наночастицы GO, функционализированные GO-PEG и GO-PEGarm разной размерности, произведены исследования белковой короны и содержания эндотоксина на этих частицах. Проведены исследования по прямому влиянию полученных наночастиц на функциональную активность нейтрофилов периферической крови, клеток моноцитарно-макрофагального ряда, а также NK и NKT клеток. Проведено исследование действия наночастиц GO-PEG и GO-PEGarm на нормальные (мононуклеарные клетки) и патологически измененные клетки (линия Jurkat) в системе прижизненного мониторирования клетки Cell-IQ. https://yadi.sk/d/LycEkLEBrFnzYA https://www.researchgate.net/project/A-study-of-the-graphene-oxide-biocompatibility-with-cells-of-the-immune-system-in-the-context-of-its-use-in-biomedicine

 

Публикации

1. Бочкова М.С., Тимганова В.П., Храмцов П.В., Ужвиюк С.В., Шардина К.Ю., Нечаев А.И., Раев М.Б., Заморина С.А. Изучение влияния наночастиц оксида графена на люминол-зависимую хемилюминесценцию лейкоцитов человека Медицинская иммунология, Т. 22, № 5, стр. 977-986 (год публикации - 2020).

2. Бочкова М.С., Тимганова В.П., Храмцов П.В., Ужвиюк С.В., Шардина К.Ю., Нечаев А.И., Раев М.Б., Заморина С.А. Influence of graphene oxide nanoparticles on the functional activity of leukocytes AIP Conference Proceedings, - (год публикации - 2020).

3. Заморина С.А., Шардина К.Ю., Тимганова В.П., Бочкова М.С., Нечаев А.И., Храмцов П.В., Раев М.Б. Effect of Graphene Oxide Nanoparticles on Differentiation of Myeloid Suppressor Cells Bulletin of Experimental Biology and Medicine, Vol. 170, No. 7, pp. 102-105. (год публикации - 2020).

4. Нечаев А.И., Храмцов П.В., Заморина С.А. Polyethylene glycol-based modification of graphene oxide AIP Conference Proceedings, - (год публикации - 2020).

5. Тимганова В.П., Заморина С.А., Бочкова М.С., Нечаев А.И., Храмцов П.В., Шардина К.Ю., Раев М.Б. Effect of pristine and pegylated graphene oxide nanosheets on the functions of human neutrophils KnE Life Sciences, - (год публикации - 2020).

6. Федорова К.И., Заморина С.А., Шардина К.Ю., Тимганова В.П., Бочкова М.С., Нечаев А.И., Храмцов П.В. Самостоятельный эффект оксида графена и пегилированного оксида графена на люминол-зависимую хемилюминесценцию в экспериментальной бесклеточной модели с перекисью водорода Фундаментальные и прикладные исследования в биологии и экологии, Материалы региональной студенческой научной конференции с международным участием, С.122-125 (год публикации - 2020).

7. Храмцов П.В., Заморина С.А., Тимганова В.П., Бочкова М.С., Раев М.Б. Взаимодействие наночастиц оксида графена с клетками иммунной системы Гены & Клетки, Том XV, №3 (год публикации - 2020).

8. Шардина К.Ю., Заморина С.А., Тимганова В.П., Бочкова М.С. Влияние наночастиц оксида графена на дифференцировку миелоидных супрессорных клеток (MDSC) Гены & Клетки, Том XV, №3, Приложение,Стр.125. (год публикации - 2020).