Аннотация результатов, полученных в 2019 году
В первый год проекта осуществлен синтез нанопластин оксида графена (ОГ) различного размера и проведена их химическая модификация полиэтиленгликолем (ПЭГ) и полиакриловой кислотой (ПАК) с последующей оценкой свойств синтезированных нанопластин (размеры, дзета-потенциал, подтверждения связывания полимеров с поверхностью оксида графена, коллоидная стабильность в культуральных средах). Проведенные исследования пегилированных образцов ОГ показали, что процесс химической пришивки прошел успешно, ароматическая структура ОГ не изменилась. При этом средний размер пластин пегилированного ОГ по сравнению с исходным, заявленным производителем 1-5 мкм, снизился до 569±14 нм. По предварительным оценкам, количество покрывающего ОГ ПЭГа составляет порядка 19-20%. Проведенные исследования состава ОГ-ПАК методом ИК-спектрометрии выявили очень слабые рефлексные полосы, характеризующие наличие функциональных групп ПАК. Таким образом, выбранные условия полимеризации АК в присутствии ОГ не позволили модифицировать последний. Для использования нанопластин ОГ в исследованиях на клетках необходимо удалить эндотоксин, концентрацию которого определяют при помощи ЛАЛ-теста. Этот тест основан на измерении поглощения реакционной смеси при 405 нм. Ввиду широкого спектра поглощения ОГ в видимом диапазоне, нанопластины сами по себе влияют на результат определения эндотоксина. Поскольку эндотоксин может неспецифически сорбироваться на поверхности нанопластин, необходимо получить референсный препарат ОГ-ПЭГ, свободный от эндотоксина. Для этого мы провели трехкратное автоклавирование ОГ-ПЭГ (120 °C, 20 мин) [Lahiani et al. DOI 10.1002/jat.3477]. Обработка гидроксидом натрия в течение 3х суток является наиболее технологически простым методом удаления эндотоксина, поскольку многократное осаждение тритоном -114 приводит к потерям части ОГ-ПЭГ. Уровень эндотоксина в препаратах ОГ-ПЭГ был менее 0,5 МЕ/мл. Исследована сорбция белков сыворотки крови на нанопластинах ОГ, нативных и модифицированных ПЭГ и ПАК и проведено количественное сопоставление их белковых корон. Белки сыворотки крови более интенсивно сорбировались на ОГ-ПЭГ, что было подтверждено количественным анализом белка по Бредфорд. Некоторое увеличение сорбции белков на поверхности наночастиц, покрытых низкомолекулярным ПЭГ, наблюдалось в работе [Petry, R. Et al. DOI: 10.1016/j.msec.2019.110080, fig. 6.]. Мы объясняем повышенную сорбцию белка снижением размеров нанопластин после функционализации ПЭГ, которое привело к увеличению удельной площади поверхности нанопластин. Данные количественного анализа сорбции белков сыворотки и IgG подтвердили данные электрофореза. Полученные наночастица ОГ и ОГ-ПЭГ исследовали на предмет их цитотоксичности на уровне клеток иммунной системы. В качестве объектов использовали мононуклеарные клетки и нейтрофилы периферической крови здоровых доноров. В работе исследовали эффекты ОГ и ОГ-ПЭГ в различных концентрациях (80 мкг/мл; 40 мкг/мл; 20 мкг/мл; 10 мкг/мл; 5 мкг/мл; 2,5 мкг/мл; 1,25 мкг/мл; 0, 625 мкг/мл; 0,312 мкг/мл; 0,156 мкг/мл; 0 мкг/мл (контроль)). Установлено, что на уровне мононуклеарных клеток (моноциты+лимфоциты) процент живых клеток в культурах с разными концентрациями графена (ОГ-ПЭГ) был от 91,5 до 96,5, и достоверного цитотоксического эффекта наночастиц не зафиксировано. В то же время, на уровне нейтрофилов процент живых клеток в культурах с разными концентрациями графена составлял от 73% до 78%, что свидетельствует о цитотоксическом эффекте наночастиц ОГ-ПЭГ на уровне нейтрофилов. Была проведена серия экспериментов по изучению влияния ОГ-ПЭГ на продукцию активных форм кислорода (АФК) суммарным пулом лейкоцитов периферической крови. Анализ кинетики хемилюминесценции нейтрофилов выявил следующие закономерности: максимальная интенсивность активированной нанопластинами ОГ-ПЭГ (5 мкг/мл и 1,25 мкг/мл) хемилюминесценции нейтрофилов в 3 раза превышала значение контрольных проб. Таким образом, ОГ-ПЭГ оказывал стимулирующий эффект на продукцию АФК общим пулом лейкоцитов, и этот эффект был достоверно выше, чем самостоятельный эффект ПЭГ и зимозана в соответствующих концентрациях. Учитывая тот факт, что наночастицы ОГ могут поглощаться клетками иммунной системы (моноциты, нейтрофилы периферической крови), мы провели серию пилотных экспериментов по оценке фагоцитарной активности клеток в отношении ОГ-ПЭГ в сравнении с нефункционализированным ОГ. Показано, что по сравнению с объектами фагоцитоза, имеющими биологическое происхождение, фагоцитоз частиц ОГ и ОГ-ПЭГ снижен, причем, функционализированный ОГ поглощается фагоцитами менее охотно, чем нефункционализированный. Была проведена серия пилотных экспериментов по изучению влияния разных модификаций ОГ на дифференцировку миелоидных супрессорных клеток (MDSC) в экспериментальной модели in vitro. Установлено, что присутствие ОГ-ПЭГ приводило к повышению процента M-MDSC в культурах (5 и 10 мкг/мл), и одновременно снижало уровень G-MDSC (5 мкг/мл). Таким образом, показано, что субпопуляции MDSC по-разному реагируют на наночастицы ОГ, при этом клетки гранулоцитарного ряда более чувствительны. В задачи первого года исследований входило также визуализация действия частиц ОГ в системе Cell-IQ. При анализе клеточной массы культуры клеток линии Jurkat было показано, что количество полиплоидных клеток на момент образования последнего полиплоида ниже при сокультивировании с наночастицами ОГ, по сравнению с культивацией без них. Анализ нормальных мононуклеарных клеток показал, что их число увеличивается в обеих моделях культивирования, без статистического различия между ними в конце эксперимента.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Все исследования по гранту во второй год были поделены на два блока – работа непосредственно с наночастицами оксида графена (GO), и работа по изучению влияния наночастиц GO на клетки иммунной системы. Была проведена функционализация наночастиц GO как обычным полиэтиленгликолем (PEG), так и разветвленным (8-arm). Это связано с тем, что данная модификация PEG может обеспечить лучшую коллоидную стабильность нанопластин, а также снизить количество белка, которое сорбируется на их поверхности. Кроме этого, в работу включили наночастицы как большого (1-5 мкм, L), так и малого размера (0,1-0,5 мкм, S), как и планировали ранее. Таким образом, в исследованиях in vitro применяли наночастицы GO-L, GO-PEG-S, GO-PEGarm-S, GO-PEG-L, GO-PEGarm-L. Проведенные исследования пегилированных образцов GO показали, что процесс химической пришивки прошел успешно, ароматическая структура GO не изменилась. Проведенные синтезы по модификации GO полиакриловой кислотой (ПАК) не дали положительных результатов. В целом, мы считаем малоперспективным продолжение синтезов по модификации GO полиакриловой кислотой, в связи с чем необходимо большее внимание уделить исследованию процесса модифицирования поверхности GO линейным и разветвленным полиэтиленгликолем и изучению их свойств. При изучении белковой короны наночастиц, полученных в 2020 г., показано, что белки сыворотки крови более интенсивно сорбируются на GO меньшего размера, что объясняется большей удельной площадью их поверхности. Уровень эндотоксина в препаратах GO-PEG (2020) был снижен до менее чем 0,1 ME/мл, в сравнении с уровнем прошлого года (0,5 ME/мл). При изучении влияния наночастиц GO на показатели функциональной активности нейтрофилов установлено следующее: частицы GO способны активно поглощаться нейтрофилами, однако пегилирование предотвращает их интернализацию клетками. При оценке влияния GO и GO-PEG на спонтанную и стимулированную продукцию активных форм кислорода (АФК) обнаружено, что внесение частиц GO и GO-PEG (25 и 50 мкг/мл) в суспензию клеток снижало показатели люминол-зависимой хемилюминесценции. В целом, покрытие частиц ОГ полиэтиленгликолем не влияет на синтез АФК клетками. Чтобы исключить самостоятельный эффект тушения люминесценции GO, мы провели эксперименты в бесклеточной системе, в которых тушения люминесценции не обнаружено. Таким образом, подавление люминесценции в клеточной системе связано с другими механизмами действия наночастиц, основанными на взаимодействии с клетками. При изучении продукции АФК под воздействием более низких концентраций GO (фармакологический спектр) установлено, что наночастицы GO-PEG (2,5 и 5 мкг/мл) угнетали продукцию АФК, в то время как наночастицы GO не оказывали достоверного эффекта. Установлено, что все используемые модификации наночастиц GO и GO-PEG индуцировали апоптоз нейтрофилов (5 и 25 мкг/мл), за одним исключением (GO-PEGarm-S, 5 мкг/мл). Таким образом, покрытие частиц разветвленным полиэтиленгликолем способно отменять апоптоз нейтрофилов. При изучении влияния наночастиц GO на показатели функциональной активности клеток моноцитарно-макрофагального ряда установлено, что наночастицы не влияют на жизнеспособность моноцитов периферической крови человека. При изучении процессов поглощения наночастиц GO моноцитами, показано, что частицы активно адгезировали на моноцитах и поглощались этими клетками, процент фагоцитирующих клеток был прямо зависим от размера наночастиц и их концентрации. Установлено, что все исследуемые наночастицы GO-PEG не оказывали значимого эффекта на продукцию АФК изолированными моноцитами, (светосумму хемилюминесценции за 30 минут), однако большие частицы в высокой концентрации (GO-PEG-L; 25 мкг/мл) стимулировали продукцию АФК. Интересно, что эффект этих частиц на суммарный уровень продукции АФК моноцитами на 90 минуте был противоположным: наблюдалось снижение показателей хемилюминесценции в пробах с GO-PEG-L (25 мкг/мл). Отдельной серией экспериментов мы оценивали влияние наночастиц GO (образцы 2019 г.) на зрелые клетки моноцитарно-макрофагального ряда. В частности, было изучено влияние GO-PEG на дифференцировку дендритных клеток (ДК) в культуре. Показано, что наночастицы GO-PEG-L снижают процентное содержание ДК в долговременной культуре мононуклеарных клеток (2,5; 5 мкг/мл). В аналогичной системе длительного культивирования оценивали влияние наночастиц GO на конверсию моноцитов в макрофаги фенотипа M1 и M2 в условиях направленной индукции в соответствующий фенотип. Показано, что GO-PEG-L индуцировали дифференцировку в M1, отмечена прямая зависимость от концентрации. Показано, что наночастицы GO-PEG-S, GO-PEGarm-S, GO-PEG-L, GO-PEGarm-L не оказывали достоверного влияния на показатели раннего и позднего апоптоза NK и NKT клеток. Также не выявлено статистически достоверных эффектов наночастиц GO на количество NK и NKT клеток в культурах, при этом размер, концентрация и тип функционализации не имел значения. При анализе влияния частиц оксида графена на культуру нормальных мононуклеарных клеток в системе Cell-IQ, наблюдалась повышенная вариативность показателей прироста клеточной массы, что обусловлено гетерогенностью клеточной культуры. В целом, прирост клеточной массы в культурах мононуклеарных клеток при краткосрочном сокультивировании с образцами GO-PEG (24 часа) был сопоставим с аналогичными параметрами контрольной группы. Жизнеспособность и динамика клеточной массы нормальных иммунокомпетентных клеток (мононуклеарные клетки) не зависит от концентрации наночастиц GO и типа функционализации поверхности. При увеличении концентрации наночастиц GO при сокультивировании с нормальными иммунокомпетентными клетками, наблюдалось увеличение флуоресценции в канале FL4, что вероятно, обусловлено присутствием моноцитарных клеток, которые активно фагоцитируют частицы GO, что согласуется с нашими данными, полученными методом проточной цитометрии. Для понимания процессов, происходящих в клетках, эффекты наночастиц оценивали на патологически измененной линии иммунокомпетентных клеток – Jurcat. Было установлено, что наночастицы GO-PEG (2020 г.) оказывали угнетающее воздействие при краткосрочном культивировании на патологически измененные иммунокомпетентные клетки, что выражалось, с одной стороны, увеличением относительного числа мертвых клеток, а с другой стороны отсутствием прироста клеточной массы относительно контрольной группы. Негативные эффекты, регистрируемые при сокультивировании Jurkat T-клеток с образцами графена, зависели от концентрации наночастиц, но не зависели от типа образца. Таким образом, по итогам второго года получены и охарактеризованы наночастицы GO, функционализированные GO-PEG и GO-PEGarm разной размерности, произведены исследования белковой короны и содержания эндотоксина на этих частицах. Проведены исследования по прямому влиянию полученных наночастиц на функциональную активность нейтрофилов периферической крови, клеток моноцитарно-макрофагального ряда, а также NK и NKT клеток. Проведено исследование действия наночастиц GO-PEG и GO-PEGarm на нормальные (мононуклеарные клетки) и патологически измененные клетки (линия Jurkat) в системе прижизненного мониторирования клетки Cell-IQ. https://yadi.sk/d/LycEkLEBrFnzYA https://www.researchgate.net/project/A-study-of-the-graphene-oxide-biocompatibility-with-cells-of-the-immune-system-in-the-context-of-its-use-in-biomedicine

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Все исследования по гранту были поделены на два блока – работа непосредственно с наночастицами оксида графена (ОГ), и работа по изучению влияния наночастиц ОГ на клетки иммунной системы. Наночастицы ОГ с латеральными размерами 100-200 нм и 1-5 мкм были функционализированы полиэтиленгликолем (ПЭГ), полимером, способным улучшать коллоидную стабильность и профиль токсичности наноматериалов. Для покрытия наночастиц использовали два типа ПЭГ, а именно линейный и разветвленный ПЭГ (8-разветвлённый ПЭГ), что основано на литературных данных, предполагающих, что разветвленная форма обеспечивает лучшую стабильность в жидкости при культивировании клеток [Xu, 2014]. Наночастицы ОГ обрабатывали хлоруксусной кислотой для введения дополнительных карбоксильных групп. Затем аминированный ПЭГ был ковалентно присоединен к карбоксилированному ОГ с помощью карбодиимида. Полученные наночастицы были охарактеризованы различными методами, включая FTIR, рамановскую спектроскопию, элементный анализ (EDS), TGA, SEM и DLS. Белковая корона пегилированных наночастиц ОГ (П-ОГ) была исследована методом SDS-PAGE. Как и ожидалось, небольшие наночастицы адсорбировали больше белка, чем крупные, из-за большей удельной поверхности. Тем не менее, пегилирование не может полностью снизить адсорбцию белка на наночастицах ОГ. Разветвленный ПЭГ более эффективно защищает поверхность наночастиц, что можно объяснить стерическими препятствиями, создаваемыми множеством цепей ПЭГ. Вероятно, происходит образование комплексов, содержащих несколько наночастиц и множество белков, поскольку увеличение концентрации П-ОГ увеличивает адсорбцию белка. Изучали влияние наночастиц ОГ на В-клетки человека в системе in vitro. Было установлено, что наночастицы ОГ не влияли на жизнеспособность В-клеток. При изучении влияния наночастиц ОГ на уровень наивных В-клеток и В-клеток памяти не было выявлено достоверных эффектов на процент этих клеток. Обнаружено, что наночастицы П-ОГ действовали цитотоксически на клетки гибридомы BAP3, одновременно снижая суммарную продукцию иммуноглобулинов этими клетками. При оценке интернализации (адгезии) частиц клетками гибридомы BAP3 обнаружено, что частицы в концентрации 5 мкг/мл практически не интернализовались, однако, однако в высокой концентрации (25 мкг/мл) активно поглощались гибридными клетками. При изучении влияния наночастиц ОГ на Т-лимфоциты показано, что наночастицы не оказывали достоверного влияния на жизнеспособность этих клеток. Обнаружено, что наночастицы ОГ не влияли на уровень провоспалительных Th1-клеток, но одновременно повышали уровень Th9, Th17 и Th17/22-клеток в культуре. Одновременно был показан подавляющий эффект наночастиц ОГ на противовоспалительные Treg и Th2-клетки. Таким образом, на уровне Т-хелперных клеток наночастицы формируют провоспалительный профиль дифференцировки. Также показано, что наночастицы ОГ не влияют уровень наивных Т-клеток иммунной памяти, а также на их конверсию в Т-клетки центральной памяти. Однако, высокие концентрации наночастиц способны уменьшать количество дифференцированных Т-клеток памяти. Изучали взаимодействие наночастиц ОГ с мононуклеарными клетками в системе прижизненного наблюдения CELL-IQ. В сравнении с прошлым годом, сопоставили эффекты наночастиц и их поглощение клетками. Показано, что наночастицы П-ОГ способны подавлять пролиферацию мононуклеарных клеток, при этом размер частиц и их концентрация не имеют принципиального значения, в то время как тип пегилирования оказывал влияние на степень выраженности эффекта. Так, покрытие наночастиц ОГ разветвлённым ПЭГ приводило к более выраженному подавлению пролиферации клеток. Анализ полученных данных по гранулярности моноцитов показал, что наночастицы малой размерности действительно поглощались моноцитами, при этом наночастицы, покрытые разветвлённым ПЭГ поглощались интенсивнее. При оценке поглощения наночастиц ОГ при помощи анализа автофлуоресценции графена в моноцитарном гейте мононуклеарных клеток было показано, что моноциты активно поглощают наночастицы ОГ, при этом заметна следующая тенденция: более активно поглощались частицы, покрытые разветвлённым ПЭГ, в концентрации 25 мкг/мл. Таким образом, по истечении 24 ч инкубирования исследуемые нами наночастицы ОГ в системе прижизненного наблюдения CELL-IQ поглощались моноцитами. Степень поглощения зависела от размера, концентрации и типа ПЭГ, покрывающего частицы. Однако, наночастицы, покрытые разветвлённым ПЭГ поглощаются, по-видимому более активно. Одновременно эти частицы подавляли пролиферацию мононуклеарных клеток, и также можно отметить, что эффект был более выражен у частиц, покрытым разветвлённым ПЭГ. Изучали морфофункциональные характеристики мезенхимальных клеток человека в условиях их сокультивирования с наночастицами оксида графена в системе прижизненной визуализации CELL-IQ. Было установлено, что наночастицы П-ОГм, рП-ОГм и П-ОГб в концентрации 5 мкг/мл обладают низким уровнем цитотоксичности при культивировании с мезенхимальными стволовыми клетками (МСК) человека. В то же время, культивирование МСК с наночастицами ОГ в концентрации 25 мкг/мл приводит к достоверному снижению относительного числа живых клеток по сравнению с контрольной группой, вне зависимости от типа наночастиц. Показано, что наночастицы рП-ОГб оказывают наиболее выраженное негативное влияние на жизнеспособность мезенхимальных клеток человека, достоверно снижая относительное число живых клеток независимо от используемой концентрации. Усредненная активность мезенхимальных клеток в первую очередь зависела от концентрации образцов, при высокой концентрации - снижалась относительно контрольной группы, а при низкой концентрации – усиливалась. Было выявлено увеличение преодолеваемого расстояния и скорости отдельных клеток, зависящее не от концентрации, а от типа частиц. При анализе метаболических процессов в клетках после взаимодействия с наночастицами ОГ на примере моноцитарной фракции (CD14+) периферических клеток человека было показано, что в культурах бо́льшая часть потребляемого моноцитами кислорода (около 80%), направлена на синтез АТФ, вне зависимости от присутствия наночастиц П-ОГ в среде. В культурах клеток с добавлением П-ОГ в высокой концентрации (25 мкг/мл) наблюдалась повышенная скорость потребления кислорода, в сравнении с клетками, которые инкубировались в среде с низкой концентрацией наночастиц (5 мкг/мл) или в их отсутствии. При этом размеры частиц не влияли на этот показатель. Усиление активности дыхательной цепи в моноцитах, инкубируемых с наночастицами ОГ в концентрации 25 мкг/мл, не сопровождалось увеличением интенсивности аэробного гликолиза. Напротив, скорость выделения в пробах с наночастицами П-ОГ в концентрации 25 мкг/мл, относительно проб с П-ОГ 5 мкг/мл или в отсутствии частиц, была понижена. Известно, что усиление активности дыхательной цепи моноцитов происходит при фагоцитозе. В наших экспериментах несмотря на то, что частицы активно поглощаются моноцитами, происходит только усиление дыхания. В результате, общий вектор эффектов П-ОГ на продукцию АФК моноцитами был супрессивным. Для наночастиц малой размерности, для реализации данного эффекта имела значение прежде всего концентрация частиц, а для наночастиц большой размерности принципиальным был именно тип пегилирования. Бо́льшая часть потребляемого клетками кислорода направлена на синтез АТФ. Повышение скорости потребления кислорода происходило только в пробах с наночастицами П-ОГ (25 мкг/мл). В этих же пробах происходило усиление активности дыхательной цепи, но оно не сопровождалось увеличением аэробного гликолиза. По итогам реализации проекта получены данные о воздействии наночастиц оксида графена на ключевые субпопуляции клеток врожденного и адаптивного иммунитета, как эффекторные, так и регуляторные. Проведена оценка влияния модификаций наночастиц ОГ линейным и разветвлённым ПЭГ, призванных улучшить биосовместимость наночастиц. В итоге мы получили данные о влиянии оптимальной (фармакологической) и сверхоптимальной концентраций наночастиц ОГ на жизнеспособность, дифференцировку и функциональную активность основных субпопуляций клеток иммунной системы. Показано, что клетки врожденного иммунитета способны поглощать наночастицы ОГ, в то время как лимфоциты лишь незначительно адгезируют или интернализируют наночастицы. Полученные данные, касающиеся эффектов наночастиц оксида графена на клетки врожденного, адаптивного иммунитета и поляризацию иммунного ответа, могут быть использованы при изготовлении безопасных иммуномодуляторов, адъювантов и лекарственных средств на основе оксида графена. https://www.researchgate.net/project/A-study-of-the-graphene-oxide-biocompatibility-with-cells-of-the-immune-system-in-the-context-of-its-use-in-biomedicine