Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Основной задачей трехлетнего исследования является структурно-функциональное изучение комплексов наночастиц разной химической природы с биорецепторными молекулами белковой (антитела) и олигонуклеотидной (аптамеры) природы и их применение для создания высокочувствительных методов детекции ионов тяжелых металлов. Одной из актуальных задач является разработка высокочувствительных и производительных аналитических методов для контроля тяжелых металлов с целью проведения широкого мониторинга загрязнений окружающей среды. Имеющиеся аналитические лабораторные методы или экспресс-методы на основе простых химических цветных реакций не позволяют решить данную задачу из-за необходимости наличия высокотехнологичного дорогого оборудования или невысокой чувствительности и селективности анализа, соответственно. Поэтому в рамках проекта предлагается объединить наиболее эффективные методические решения по биорецепторной детекции тяжелых металлов, такие как: • применение в качестве эффективных фото- и флуориметрических маркеров детекции комплексов различных нанодисперсных частиц металлов, оксидов металлов, многослойных полупроводниковых композитов разных размеров и формы; • применение биорецепторных взаимодействий в мембранных системах продольного и поперечного потока, минимизирующих трудоемкость анализа за счет разделения компонентов пробы и детектируемых комплексов; • реализация подходов для снижения предела обнаружения анализа, в том числе переход от детекции единичной маркерной частицы к регистрации оптического сигнала от агрегата из нескольких сотен и тысяч частиц. Реализация данного проекта предполагает получение сравнительной характеристики различных нанодисперсных маркеров и биорецепторных молекул, выбор эффективных аналитических протоколов и формирование фундаментальных основ для биотехнологий производства тест-систем для определения тяжелых металлов (свинца, ртути) в объектах окружающей среды. Результатом выполнения работ по проекту будет выявление взаимосвязей между характеристиками биорецепторных молекул и нанодисперсных маркеров, используемых в тест-системах, и пределом обнаружения целевых аналитов, а также разработка иммунохроматографических и иммунофильтрационных систем контроля токсичных веществ на основании полученных выводов и методических решений по чувствительному определению катионов тяжелых металлов. Для понимания особенностей иммобилизации антител и аптамеров на поверхности наночастиц, а также взаимодействия конъюгатов маркер – биорецепторная молекула с детектируемыми соединениями работы 2019 года были направлены на получение и характеристику конъюгатов, различающихся по: - виду наночастиц-носителей, - размерам и составу наночастиц; - способам иммобилизации. Охарактеризованы реагенты для специфической детекции ртути и свинца, а также синтезированные в лаборатории наночастицы коллоидного золота разного размера и полученные в кооперации с индийским партнером по проекту наночастицы состава Ag-Au, Ag-Cu. Проведена оценка сродства препаратов немодифицированных антител к тяжелым металлам методами иммуноферментного анализа с использованием соответствующего комплекса иона с хелатирующим агентом. Охарактеризованы препараты немодифицированных аптамеров методом малоуглового рентгеновского рассеяния с использованием синхротронного излучения. Проведена оценка селективности немодифицированных антител и аптамеров к определяемому иону с использованием метода иммуноферментного анализа. Разработана методика оценки селективности с использованием метода спектрофотометрии. Данная методика основана на выявлении разницы оптической плотности при 620 нм растворов аптамеров, модифицированных и немодифицированных наночастицами золота, соответственно. Определены размерные и поверхностные характеристики немодифицированных цитрат-стабилизированных наночастиц золота и конъюгатов на их основе с использованием методов молекулярной электронной спектроскопии, просвечивающей электронной микроскопии, методов динамического рассеяния света и дифракции обратно рассеянных электронов, Ик-спектроскопии Фурье. Показана взаимодополняемость характеристик наночастиц, получаемых разными методами. Получены конъюгаты нанодисперсных маркеров с олигонуклотидными последовательностями различного состава путем специфического взаимодействия тиольных групп с поверхностью наночастиц. Показано влияние концентрации биорецепторных молекул на предел обнаружения целевых аналитов. Проведена апробация полученных препаратов модифицированных нанодисперсных маркеров в гомогенном анализе. Разработана методика определения сурьмы, основанная на взаимодействии золотых наночастиц, модифицированных поли-А аптамером и регистрации результата визуально или методом фотометрии. Применение разработанной методики позволяет проводить определение сурьмы (III) в питьевой воде с пределом обнаружения 10 нг/мл и продолжительностью анализа 2 минуты. Продемонстрирована возможность повышения чувствительности электрохимического определения катионов мышьяка при замене золотых наночастиц на наночастицы состава Ag-Au и использовании аптамера сложного состава. Показана высокая чувствительность (1 мкг/мл) гомогенного анализа ртути с использованием золотых наночастиц, модифицированных поли-А аптамером. Отмечено также взаимодействие и с рядом других катионов, например, As3+, Cr3+, Mn2+, Pb2+, когда их концентрация превышает 0,3 мкг/мл, 0,6 мкг/мл, 1 и 1 мкг/мл, соответственно. Для разработки гетерогенного формата анализа (иммунохроматография) получены комплексы белков с различными рецепторными молекулами и конъюгаты на их основе с нанодисперсными маркерами. Проведена характеристическая оценка препаратов конъюгатов методом УФ-спектрофотометрии. Применение разработанной методики гомогенного анализа в сопровождении с хроматографическим разделением позволяет снизить предел обнаружения катионов свинца до 1 нг/мл.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Основной задачей трехлетнего исследования является разработка новых чувствительных и селективных тест-систем для определения ионов тяжелых металлов для проведения мониторинга в различных объектах окружающей среды. Методики, используемые на данный момент в мониторинге, предполагают использование сложного дорогостоящего оборудования, либо экспресс-методики с недостаточным пределом обнаружения. Поэтому второй год проекта посвящен изучению закономерностей экспрессной детекции тяжелых металлов, а также подготовке и характеристике соответствующих тест-систем. Разработано несколько вариантов тест-систем, основанных на двух форматах определения аналитов – гомогенном (агрегационном либо каталитическом) и гетерогенном (хроматографическом, мембранном), в том числе продемонстрирована возможность сочетания с методом ГКР и электрохимическими методами. Для каждого вида анализа подобран комплект реагентов – от синтезируемых конъюгатов для иммобилизации на мембрану (БСА с аминофенилборной кислотой и глутатионом) до проявляющих конъюгатов золотых наночастиц с рецепторными молекулами: • наночастицы с аптамерами (для гомогенных и хроматографических систем определения ртути и свинца); • наночастицы с меркаптоянтарной кислотой, иммобилизованной на их поверхность (для определения ртути и кадмия); • наночастицы с меркаптоянтарной кислотой в качестве стабилизирующего и восстанавливающего агента, используемой в процессе синтеза (для гомогенных систем определения железа); • наночастицы с таниновой кислотой в качестве восстанавливающего и стабилизирующего агента (для каталитических систем определения ионов свинца). Принцип гомогенного агрегационного анализа основан на взаимодействии модифицированных наночастиц с определяемым аналитом в гомогенной среде, протекающем со сближением наночастиц, потерей их агрегационной и седиментационной устойчивости вследствие формирования крупных кластеров, и в конечном счете агрегацией. Для понимания закономерностей протекания взаимодействия в гомогенном анализе проведено математическое моделирование с помощью программного пакета COPASI и проведено сравнение с экспериментальными данными. Получены и охарактеризованы препараты наночастиц золота с таниновой кислотой и меркаптоянтарной кислотой, использованные в гомогенном анализе. Разработаны гомогенные колориметрические системы для определения ионов тяжелых металлов (Hg2+ и Cd2+, Fe3+, Pb2+), при этом специфичность взаимодействия определяется выбранной рецепторной молекулой, иммобилизованной на поверхности золотой наночастицы, либо используемой в качестве восстанавливающего и стабилизирующего агента при синтезе наночастиц. Иммобилизация меркаптоянтарной кислоты на поверхности золотых наночастиц позволила фотометрически детектировать ионы ртути и кадмия при концентрациях 21,5 нг/мл и 12,1 нг/мл, соответственно. Применение конъюгата наночастицы-меркаптоянтарная кислота показало возможность обнаружения ионов железа до 10 нг/мл. Продемонстрировано использование таниновой кислоты в каталитической системе определения ионов свинца до 3,2 нг/мл, где для визуальной оценки каталитической активности наночастиц золота использовали тетраметилбензидин. Для гетерогенного формата анализа (иммунохроматография) получены комплексы белка БСА с аминофенилфборной кислотой (АФБК) и глутатионом. Показано применение иммунохроматографической системы с использованием конъюгата БСА-АФБК и конъюгата золотых наночастиц с поли-С олигонуклеотидной последовательностью для инструментального определения ионов Pb2+ в концентрациях до 0,05 нг/мл и визуального - до 1 нг/мл, рабочий диапазон определяемых концентраций составил 0,1 – 5 нг/мл. Время анализа составило 5 мин. Применение конъюгата БСА-глутатион обеспечило прямую зависимость аналитического сигнала от содержания ионов, обусловленную накоплением комплексов металл-олигонуклеотид-наночастица. Проведенная совместно с индийской стороной работа по электрохимическому определению ионов свинца продемонстрировала возможности использования биметаллических частиц состава Ag-Au, конъюгированных с гуанин-, тимин-обогащенным аптамером. Система апробирована на пробах воды, отобранной в северной Индии, показав возможность детекции ионов свинца в диапазоне концентраций 0,01–10 мкг/л.