КАРТОЧКА
ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ
Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.
ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ
Номер 19-73-00224
НазваниеМодификация биологически-активных молекул фотохромными центрами - путь к созданию дистанционно-контролируемых фотофармакологических препаратов
РуководительОжогин Илья Вячеславович, Кандидат химических наук
Организация финансирования, регион федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Южный федеральный университет", Ростовская обл
Период выполнения при поддержке РНФ | 07.2019 - 06.2021 |
Конкурс№40 - Конкурс 2019 года «Проведение инициативных исследований молодыми учеными» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными.
Область знания, основной код классификатора 03 - Химия и науки о материалах, 03-101 - Синтез, строение и реакционная способность органических соединений
Ключевые словаспиропиран, фотохромизм, молекулярный переключатель, фотофармакология, биологическая активность, органический синтез, гетероциклические соединения, биомедицина
Код ГРНТИ31.21.27
СтатусУспешно завершен
ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ
Аннотация
Фотофармакология – новая развивающаяся отрасль биомедицины, в которой контроль над биоактивностью осуществляется за счет введения молекул-фотопереключателей в структуру биоактивных препаратов. Модифицированное фоторецептором биоактивное вещество (фотофармакологический агент) под воздействием светового облучения изменяет свои свойства, например форму, липофильность, дипольный момент и т. д. Поскольку фармакодинамические и фармакокинетические свойства лекарственного препарата непосредственно связаны с его молекулярной структурой, две фотоизомерные формы обладают различной биоактивностью. Внешний механизм контроля биологической активности препаратов позволяет вызвать фармакологическую реакцию при взаимодействии со строго определенной молекулярной мишенью в организме (конкретный фермент, рецептор, ионные каналы и т.д.), что обеспечивает высокую степень селективности (избирательности) действия биоактивного препарата.
В качестве молекул-фотопереключателей для осуществления светового контроля над биоактивностью препаратов с помощью активирующего излучения нами предлагается использовать спиропираны (далее СП) – один из наиболее перспективных и широко изучаемых классов органических фотохромов.
Актуальность задачи связана с тем фактом, что практически невозможно предсказать биологическую активность определенного модифицированного препарата. Для создания эффективных биоактивных агентов с фотопереключаемой функцией требуются исследования зависимости между структурой и активностью для различных состояний фотопереключателя. Мировые исследования в данной области зачастую являются пионерскими и носят по большей части разрозненный характер, поэтому решение поставленных задач, связанных с систематическими сериями соединений, несомненно, требуют проведения масштабных исследований. В рамках предлагаемого проекта предполагается проведение широкой характеризации биологических эффектов синтезируемых соединений - от влияния на жизнеспособность и пролиферацию клеток бактерий и человека до установления их влияния на состояние сигнальных систем клетки, которые предопределяют возможность развития лекарственной резистентности клеток. Таким образом, будут определены потенциальные направления применения новых спиропиранов и одновременно - их возможные побочные эффекты и пути предотвращения снижения терапевтической эффективности.
Ожидаемые результаты
В ходе выполнения работ по проекту будут разработаны универсальные пути модификации биоактивных молекул фотохромными центрами. На основе молекул спиропиранов будет синтезирован и всесторонне исследован большой массив органических соединений, обладающих светоконтролируемыми свойствами. Полученные результаты работы дополнят имеющиеся фундаментальные данные о связи структуры и свойств фотохромных соединений и позволят в дальнейшем с большей точностью осуществлять направленный синтез фоточувствительных соединений с заданными свойствами. Биологические исследования полученных соединений позволят получить уникальные данные о цитотоксичности фотохромных соединений по отношению к бактериальным и человеческим опухолевым клеткам, а также информацию о влиянии этих соединений на состояние защитных (детоксификационных и антиоксидантных) каскадов клеток человека, что позволит сделать заключения о корреляции между структурой модифицированных спиропиранов и их биоактивностью. Полученные в ходе исследований тандемные молекулярные системы "спиропиран - биомолекула" могут найти применение в качестве фотофармакологических агентов с дистанционно управляемым терапевтическим действием.
ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ
Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Фотофармакология является быстро развивающейся отраслью биомедицины, которая подразумевает возможность контролировать биологическую активность препарата под воздействием света. Этот контроль осуществляется за счет введения в структуру биологически активных веществ молекул фотопереключателей, которые под воздействием активирующего излучения изменяют физические и, как следствие, фармакодинамические и фармакокинетические свойства вещества. Использование данной концепции должно привести к повышению селективности действия биологического препарата, что позволит уменьшить или полностью избежать потенциально серьезных побочных эффектов.
Данный проект посвящен поиску и реализации эффективных путей модификации биологически активных соединений фотохромными центрами в виде молекул спиропиранов и созданию на их основе гибридных фотофармакологических агентов, активностью которых можно будет управлять с помощью света, а также других внешних стимулов.
Подводя итоги первого этапа, нами было синтезировано и изучено три новых модельных спиропирана индолиновой серии, модифицированных различными электроноакцепторными реакционноспособными заместителями, такими как карбоксильные, формильные и метоксикарбонильные группы. Структура целевых соединений была подтверждена методами ЯМР, ИК-спектроскопии и элементного анализа. Молекулярная структура 8'-формил-1,3,3,6'-тетраметилспиро[индолин-2,2'-2Н-хромен]-5-карбоновой кислоты была уточнена с помощью рентгеноструктурного анализа, который показал, что молекулы исследуемого спиропирана расположены в виде димерных ассоциатов в его монокристаллах за счет образования двух межмолекулярных водородных связей между атомами водорода и карбонильными атомами кислорода соседних молекул. Данный результат является первым надежно доказанным примером образования прочносвязанных димеров индолиновых спиропиранов в кристаллической фазе.
Фотохимические исследования выявили наличие фотохромных свойств у каждого из полученных соединений. Было показано, что грамотная модификация индолиновых спиропиранов различными электроноакцепторными карбонильными заместителями, отличными от нитрогруппы, может привести к значительному усилению их фотоокрашиваемости и увеличению времени жизни мероцианиновой формы в 8-30 раз.
В ходе реализации одного из путей модификации биоактивных молекул фотохромными центрами нами были синтезированы четыре спироиндолинонафтопирана, содержащих гидроксигруппу в нафтопирановом фрагменте молекулы, и три новых гибрида с биологически активной α-липоевой кислотой на их основе. Структура целевых гибридов была подтверждена с помощью FT-IR, 1H и 13C ЯМР-спектроскопии (с использованием 2D-методов, таких как COSY 1H–1H, HSQC 1Н–13C, HMBC 1Н–13С, HMBC 1H–15N), масс-спектрометрии высокого разрешения и элементного анализа. Молекулярная структура 6'-гидрокси-1,3,3-триметилспиро[индолин-2,2'-бензо[f]хромена] была уточнена с помощью рентгеноструктурного анализа.
Результаты фотохимических исследований выявили положительное влияние электронодонорного заместителя в гетереновом фрагменте молекулы на ее фотохромную активность. Так, оба 5-метоксизамещенных спиропирана обладали фотохромными свойствами при комнатной температуре в растворе ацетонитрила в отличие от их незамещенных и хлор-замещенных аналогов.
Были проведены сравнительные исследования цитотоксичности серии из трех спироиндолинонафтопиранов, их гибридов и α-липоевой кислоты на человеческих клеточных культурах HeLa при двух концентрациях - 500 мкМ и 2 мМ. Было обнаружено, что хотя три исходных (для гибридов) спиропирана и отличались по цитотоксичности в модельной системе, все их гибриды с АЛК оказались неожиданно и одинаково безопасными - даже при высокой концентрации в 2 мМ. В этих условиях даже известная своей безопасностью АЛК имела некоторую токсичность, относительно безопасная молекула 6'-гидрокси-1,3,3-триметилспиро[индолин-2,2'-бензо[f]хромена] приводила к снижению жизнеспособности клеток, а 5-метоксизамещенный спиропиран вызывал почти полную гибель клеток. Таким образом, непредсказуемая безопасность гибридов подчеркивает перспективность проявляющихся эффектов конъюгации спиропиранов с биологически активными веществами (на модели АЛК) и обосновывает необходимость дальнейших исследований долгосрочных эффектов (как предполагаемых, так и неблагоприятных) и деградации гибридных спиропиранов в биологических системах. Принимая во внимание результаты настоящего исследования, мы разработали эксперимент долгосрочного тестирования, направленный на оценку соответствующих свойств гибридов, первичные результаты которого показали различную кинетику образования и различную токсичность продуктов распада гибридных соединений.
Публикации
1. Ожогин И.В., Золотухин П.В., Муханов Е.Л., Ростовцева И.А., Макарова Н.И., Ткачев В.В., Беседа Д.К., Метелица А.В., Лукьянов Б.С. Novel molecular hybrids of indoline spiropyrans and α-lipoic acid as potential photopharmacological agents: synthesis, structure, photochromic and biological properties Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, Volume 31, 1 January 2021, 127709 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.1016/j.bmcl.2020.127709
2. Ожогин И.В., Радченко Е.А., Пугачев А.Д., Козленко А.С., Ростовцева И.А., Лукьянов Б.С. СИНТЕЗ И ИССЛЕДОВАНИЕ ФОТОХРОМНОГО СПИРОПИРАНА, МОДИФИЦИРОВАННОГО ФРАГМЕНТОМ ЛИПОЕВОЙ КИСЛОТЫ "Дизайн полифункциональных структур: теория и синтез": тезисы докладов научной конференции (Ростов-на-Дону, 12–18 октября, 2019 г.); Южный федеральный университет. – Ростов-на-Дону; Таганрог: Издательство Южного федерального университета, 2019. – 56 c., "Дизайн полифункциональных структур: теория и синтез": тезисы докладов научной конференции (Ростов-на-Дону, 12–18 октября, 2019 г.); Южный федеральный университет. – Ростов-на-Дону; – C. 41. (год публикации - 2019)
Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Фотофармакология является быстро развивающейся отраслью биомедицины, которая подразумевает возможность контролировать биологическую активность препарата под воздействием света. Этот контроль осуществляется за счет введения в структуру биологически активных веществ (БАВ) молекул фотопереключателей, которые под воздействием активирующего излучения изменяют физические и, как следствие, фармакодинамические и фармакокинетические свойства вещества. Использование данной концепции должно привести к повышению селективности действия биологического препарата, что позволит уменьшить или полностью избежать его потенциально серьезных побочных эффектов.
Данный проект посвящен поиску и реализации эффективных путей модификации биологически активных веществ фотохромными центрами в виде молекул спиропиранов (СП) и созданию на их основе гибридных фотофармакологических агентов, активностью которых можно будет управлять с помощью света, а также других внешних стимулов.
В ходе выполнения запланированных работ нами было синтезировано два новых СП индолинового ряда, оснащенных карбоксильной группой в гетареновой части и формильной группой в 2Н-хроменовом фрагменте. Строение полученных СП было установлено методами ИК, ЯМР 1H и 13C спектроскопии (с использованием различных двумерных методик). Спектрально-кинетические исследования выявили фотохромную активность соединений при комнатной температуре, причем времена жизни мероцианиновых форм СП лежали в диапазоне 19.0 – 21.4 с, а рассчитанные энергии активации реакции термической рециклизации составили 78.0 – 80.5 кДж/моль, что подтверждает их перспективность для использования в качестве строительных блоков для связывания с БАВ.
Далее нами были отработаны эффективные методики формилирования гормонов эстрогенового ряда - β-эстрадиола и эстрона. На основе полученных нами 2-формил-β-эстрадиола и 2-формилэстрона было синтезировано шесть новых спироциклических производных гормонов, содержащих разные заместители в положении 5 индолинового фрагмента. Строение полученных соединений было подтверждено с помощью данных ИК, ЯМР 1Н и 13С спектроскопии с использованием двумерных методик (COSY 1H-1H, HSQC 1H-13C, НMBC 1H-13C и НMBC 1H-15N), а также масс-спектрометрии высокого разрешения.
Фотохимические исследования полученных соединений показали, что все соединения данного ряда при комнатной температуре в растворе существуют исключительно в спироциклической форме и не проявляют выраженной фотохромной активности вне зависимости от растворителя. Однако, для соединений эстрадиольного ряда были детектированы и исследованы ацидохромные свойства в растворе ацетонитрила. При добавлении трифторуксусной кислоты бесцветные растворы приобретали интенсивную желтую окраску за счет изомеризации циклических форм в протонированные мероцианиновые формы, а в спектрах поглощения соединений появлялась характерная для данных изомеров широкая полоса поглощения в видимой области с максимумом при 401 нм. При этом добавление к окрашенным растворам СП триэтиламина вновь приводило к обесцвечиванию, что говорит об обратимости данной изомеризации. Полученные данные позволяют рассматривать полученные гибридные спиропираны, содержащие конденсированный фрагмент гормона β-эстрадиола, в качестве фармакологических препаратов, активность которых будет зависеть от рН среды.
Исследования цитотоксичности новых СП ряда β-эстрадиола и эстрона были проведены на клетках HeLa в сравнении с промежуточными формилированными производными соответствующих эстрогенов для двух концентрациий соединений (50 и 200 мкМ) и выявили, что спироциклические производные проявляют отличные и неаддитивные по отношению к своим компонентам свойства. Так, СП эстрадиольного ряда в отличие от 2-формил-β-эстрадиола были выраженно токсичны уже при 50 мкМ. В более высокой концентрации токсичность всех производных эстрадиола значительно возрастает, при этом токсичность незамещенного СП превышает таковую для 2-формил-β-эстрадиола, вызывая гибель около 68% клеток, а токсичность метоксизамещенного СП находится примерно на одном с ним уровне (39% против 41%). СП же эстронового ряда, отличающиеся заместителем в 5 положении индолиновой части молекулы, так же, как и их предшественник 2-формилэстрон, не проявляют выраженной токсичности для клеток HeLa при концентрации 50 мкМ. Однако их эффекты несколько отличаются при увеличении концентрации в среде до 200 мкМ. Так, немодифицированный СП вызывает в таких условиях гибель примерно 25% клеток, тогда как его 5-метокси- и 5-хлор-производные остаются нетоксичными, в отличие от 2-формилэстрона, вызывающего при данных условиях гибель примерно 50% клеток. Резюмируя, можно сказать, что наиболее высокой цитотоксичностью в обоих рядах обладают СП с незамещенным по 5 положению индолиновым фрагментом, что является довольно неожиданным результатом, требующим дальнейших исследований. Выявленная картина свидетельствует в пользу возможности применения синтезированных соединений в различных стратегиях борьбы со злокачественными клетками. Так, остро токсичные СП эстрадиольного ряда могут использоваться для высокоэффективного уничтожения клеток in situ или при условии адресной доставки или управляемого изменения свойств.
Также на данном этапе нами были продолжены исследования биологической активности и структурных факторов, оказывающих на нее влияние, для гибридных СП, содержащих фрагмент альфа-липоевой кислоты (АЛК). Молекулярная структура 5-метокси- и 5-хлорзамещенных соединений была детально исследована с помощью рентгеноструктурного анализа. Полученные данные свидетельствуют о высокой лабильности липоевых фрагментов в молекулах, которая достигается как за счет собственной подвижности алкильной цепи, так и вследствие неполного сопряжения между атомами кислорода сложноэфирной группы и деформированным нафталиновым фрагментом. Такая повышенная лабильность также может косвенно указывать на возможность образования более прочных невалентных взаимодействий, например, в случае лиганд-белковых комплексов. Результаты молекулярного докинга показали повышение возможной аффинности спироциклических производных к белку амилину по сравнению с АЛК, для которой ранее была показана ингибирующая активность, что указывает на высокий потенциал полученных соединений для использования в качестве ингибиторов агрегации указанного белка. При этом наиболее перспективным кандидатом является метоксизамещенный СП, для которого помимо наибольшей по модулю оценочной энергии связывания были предсказаны гидрофобные взаимодействия с аминокислотными остатками на одном из ответственных за амилоидогенность участке молекулы. Также для данного соединения ранее была зарегистрирована склонность к фотоиндуцируемой изомеризации, что позволяет рассматривать его в качестве потенциального фотофармакологического агента с управляемой биологической активностью.
Используя проточную цитофлуориметрию, мы оценили, вызывают ли АЛК и гибридные СП изменения в окислительном статусе модельных клеток HeLa, подвергнутых воздействию 500 мкМ и 2 мМ растворов веществ в течение 24 часов. В частности, мы проанализировали количественные изменения в цитозольных АФК, митохондриальных плюс ядерных АФК, а также в клеточных тиолах (в основном, в глутатионе). Полученные результаты показали, что оба гибрида активно модулировали окислительный статус модельных клеток после 24 часов обработки. Среди двух гибридов метоксизамещенный СП вызывал наиболее сильные изменения окислительного статуса и наиболее эффективно действовал при более низкой концентрации. Механизмы гипериндукции тиолов за счет более высокой концентрации данного СП убедительно указывают на необходимость дальнейших исследований на уровне клеточной передачи сигналов. По-видимому, оба гибрида продемонстрировали эмерджентные свойства по сравнению с самой АЛК, и эти свойства, скорее всего, были сигнально-зависимыми, а не чисто биохимическими - очевидно, имело место усиление сигнализации антиоксидантной системы. В совокупности результаты проточной цитометрии показали, что оба гибрида спиропиранов обладают новыми биохимическими и сигнальными антиоксидантными свойствами, превосходящими таковые свойства АЛК. Наиболее же перспективным для дальнейшего исследования также можно выделить 5-метоксизамещенный гибрид
Публикации
1. Ожогин И.В., Золотухин П.В., Ткачев В.В., Пугачев А.Д., Козленко А.С., Беланова А.А., Алдошин С.М., Лукьянов Б.С. Синтез и исследование нового индолинового спиропирана и его производного с альфа-липоевой кислотой, обладающих низкой цитотоксичностью Известия Академии наук. Серия химическая., Том 70, №7, рег. № статьи 7487 (год публикации - 2021)
2. Ожогин И.В., Ткачев В.В., Козленко А.С., Пугачев А.Д., Лукьянова М.Б., Алдошин С.М., Минкин В.И., Лукьянов Б.С. СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ СТРУКТУРЫ И МОЛЕКУЛЯРНЫЙ ДОКИНГ ИНДОЛИНОВЫХ СПИРОПИРАНОВ, СОДЕРЖАЩИХ ФРАГМЕНТ АЛЬФА-ЛИПОЕВОЙ КИСЛОТЫ Доклады Российской академии наук. Химия, науки о материалах, - (год публикации - 2021)
3. Ожогин И.В., Золотухин П.В., Козленко А.С., Пугачев А.Д., Чмыхало В.К., Быкусов В.В., Лукьянов Б.С. Молекулярные гибриды фотохромных индолиновых спиропиранов и альфа-липоевой кислоты как потенциальные фотофармакологические агенты Сборник тезисов IV Международной конференции «Современные синтетические методологии для создания лекарственных препаратов и функциональных материалов» (MOSM2020). Екатеринбург, 16-20 ноября 2020 года, Сборник тезисов IV Международной конференции «Современные синтетические методологии для создания лекарственных препаратов и функциональных материалов» (MOSM2020). OR-33. (год публикации - 2020)
Возможность практического использования результатов
не указано