Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Изучены основные способы синтеза полупродукта витании Е (2,3,5-триметилгидрохинона) и витамина К (2-метил-1,4-нафтохинона). Установлено, что 2,3,5-триметилгидрохинон в основном получают путем окисления 2,3,6-триметилфенола до 2,3,5-триметилбензохинона с последующим его гидрирование до конечного продукта. При этом могут использоваться различные окислители и катализаторы. При получении 2-метил-1,4-нафтохинона могут использоваться такие субстраты как 2-метилнафталин и 2-метилнафтол. В качестве альтерантивного экологически безопасного окислителя можно использовать пероксид водорода. Также изучены различные способы синтеза магнитных наночастиц и способы иммобилизации на них ферментов, в частности пероксидазы корня хрена. Разработаны методика синтеза и определен оптимальный состав биокатализатора на основе пероксидазы, иммобилизованной на сверхсшитый полистирол марки МN100. Установлено, что концентрация глутарового альдегида равная 0,2 г/л является оптимальной для активации сверхсшитого полистирола в синтезе биокатализатров окисления 2,3,6-триметилфенола и 2-метилнафтола с помощью пероксида водорода. Экспериментально изучены две методики синтеза магнитных наночастиц: метод соосаждения и полиольный метод. Для синтеза полиольным методом использовались два растворителя полиэтиленгликоль и этиленгликоль. Изучен механизм образования наномагнитных кластеров при получении магнитных наночастиц полиольным методом. Разработаны методики синтеза образцов биокатализаторов на основе пероксидазы иммобилизованной на магнитные наночастицы. Для модификации и активации поверхности носителя предварительно использовались 3-аминопропилтриэтоксисилан и глутаровый альдегид, соответственно. 3-аминопропилтриэтоксисилан необходим для образования прочной связи между компонентами катализатора за счет образования связи между гидроксильными группами на поверхности носителя и кремнием, входящим в состав 3-аминопропилтриэтоксисилана, и для появления на поверхности носителя аминогрупп с высокой реакционной способностью. Сшивающий агент - глутаровый альдегид - необходим для образования азометиновой связи между аминогруппами на поверхности носителя и аминогруппами пероксидазы хрена, что способствует прочному закреплению фермента на поверхности носителя. После обработки модифицирующим и активирующим агентами поверхности носителя проводилась иммобилизация пероксидазы на магнитные наночастицы. Установлено, что оптимальная концентрация глутарового альдегида для обработки носителя в синтезе биокаталитических образцов на основе пероксидазы, иммобилизованной на магнитные наночастицы является 0,2 г/л. Так же установлено, что биокатализатор на основе пероксидазы, иммобилизованной на магнитные наночастицы, синтезированные полиольным методом с использованием этиленгликоля в качестве растворителя показал лучшие результаты в окислении 2,3,6-триметилфенола и 2-метилнафтола пероксидом водорода по сравнению с другими биокатализаторами на основе иммобилизованной пероксидазы.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
При выполнении работ по второму этапу проекта с помощью метода просвечиващей электронной микроскопии была определена морфология магнитных наночастиц, синтезированных с помощью метода соосаждения и полиольным способом. Установлено, что магнитные наночастицы Fe3O4, синтезированные методом соосаждения имеют зернистую неоднородность. С помощью вибрационного магнитометра определено, что такие частицы обладали намагниченностью 58 Ам2/кг. Наночастицы, синтезированные полиольным методом образовывали крупные кластеры, которые состояли из множества отдельных небольших наночастиц. Намагниченность наномагнитных кластеров составляла 92 Ам2/кг, поэтому они были выбраны в качестве носителя для иммобилизации фермента, поскольку они проще отделяются от реакционной среды. С синтезированными биокатализаторами на основе пероксидазы, иммобилизованной на магнитные наночастицы и сверхсшитый полистирол марки MN 100 проводились эксперименты по определению оптимальных параметров (температура и значение рН) процессов окисления 2,3,6-триметилфенола и 2-метил-1-нафтола. Оптимальная температура для исследуемых процессов - 40 ˚С. Установлено, что магнитоотделяемый биокатализатор обладает термостабильностью за счет каталитической активности магнитных наночастиц. Для процесса окисления 2,3,6-триметилфенола в присутствие пероксидазы, иммобилизованной на магнитные наночастицы и сверхсшитый полистирол марки MN 100 оптимальным значением рН является 6.5. При окислении 2-метил-1-нафтола в присутствие пероксидазы иммобилизованной на сверхсшитый полистирол оптимальное значение рН, также, составляло 6.5. При использовании в качестве катализатора пероксидазы иммобилизованной на Fe3O4 максимальная скорость окисления 2-метил-1-нафтола достигалась при значении рН 7.0. Синтезированные биокатализаторы на основе пероксидазы иммобилизованной на магнитные наночастицы и сверхсшитый полистирол марки MN 100 оказались стабильными в течение 5 последовательных рециклов. Среди синтезированных биокатализаторов наибольшая начальная скорость окисления 2,3,6-триметилфенола и 2-метил-1-нафтола достигалась при использовании пероксидазы, иммобилизованной на магнитные наночастицы Fe3O4 – 6,29 мкмоль/л·мин и 0,187 ммоль/л·мин, соответственно. В то время как при использовании пероксидазы иммобилизованной на сверхсшитый полистирол марки MN 100 скорость реакции достигала лишь 2,56 мкмоль/л·мин для процесса окисления 2,3,6-триметилфенола и 0,153 ммоль/л·мин для процесса окисления 2-метил-1-нафтола. Поэтому оптимальным биокатализатором процесса окисления 2,3,6-триметилфенола и 2-метил-1-нафтола является биокаталитическая система на основе пероксидазы иммобилизованной на магнитные наночастицы Fe3O4. К тому же, такой биокатализатор обладает таким преимуществом, как простота его отделения от реакционной смеси. Определено, что с увеличением времени окислении 2,3,6-триметилфенола до 5 часов выход целевого продукта при использовании нативной HRP увеличивается практически до 100 %, при использовании биокатализатора на основе пероксидазы иммобилизованной на магнитные наночастицы выход достигал 72 %. При окислении 2-метил-1-нафтола в течение 3,5 часов в присутствии нативной пероксидазы выход продукта составлял практически 100 %, при использовании пероксидазы иммобилизованной на Fe3O4 выход целевого продукта составлял 89 %. Для оптимальной биокаталитической системы исследуемых процессов окисления проводился физико-химический анализ. С помощью метода ИК Фурье спектроскопии установлено, что пероксидаза была ковалентно иммобилизована на магнитные наночастицы. О чем свидетельствует наличие соответствующих связей на поверхности носителя. С помощью низкотемпературной адсорбции азотом, доказано, что биокатализатор на основе пероксидазы, иммобилизованной на магнитные наночастицы имеет мезопористую структуру, что способствует лучшему закреплению фермента на носителе. Диаметр пор составляет в среднем 4-11 нм, который обеспечивает свободный доступ молекулы HRP, имеющий средний диаметр нативной молекулы 4 нм. В ходе работ по проекту были разработаны методики синтеза биокатализаторов на основе пероксидазы иммобилизованной на магнитные наночастицы и сверхсшитый полистирол марки MN 100, а также методики окисления 2,3,6-триметилфенола до 2,3,5-триметилгидрохинона (полупродукта витамина Е) и окисления 2-метил-1-нафтола до 2-метил-1,4-нафтохинона (витамина К) в присутствие синтезированных биокатализаторов, в том числе магнитоотделяемых.