Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Объектом исследования проекта являются представители 10-членных лактонов (ноненолидов) – группы природных соединений, образуемых преимущественно микромицетами. Представители этого обширного семейства вторичных метаболитов грибов различаются длиной алкильной цепи при атоме С-9, наличием и положением двойных связей, гидроксигрупп, карбонильных и эпоксидных групп, конфигурацией заместителей. Из экстрактов гриба Stagonospora cirsii при помощи различных хроматографических методов мы выделили восемь природных 10-членных лактонов - стагонолиды A, E, J, K, гербарумин I, курвулид А и пиренолид С. В качестве характеристики их биологической активности мы оценили их фитотоксичность в отношении надколотых листовых дисков осота полевого, антимикробную активность против Bacillus subtilis, контактную инсектицидную активность в отношении злаковой тли и способность подавлять прорастание конидий фитопатогенных грибов Bipolaris sorokiniana, Alternaria tenuissima, Fusarium culmorum и S. cirsii. Стагонолиды A, J и K, как и гербарумин I показали высокую фитотоксическую активность в опыте на надколотых листовых дисках. Стагонолид Е и курвулид А не проявили активности в данном биотесте. Стагонолид L и пиренолид С продемонстрировали слабую фитотоксическую активность. Среди всех соединений только стагонолиды А, Е и пиренолид С продемонстрировали антимикробную активность. Стагонолид А в концентрации 100 мкг/мл подавлял прорастание конидий всех тест-грибов, в том числе, гриба-продуцента. Стагонолид E на 70% снижал всхожесть конидий F. culmorum, но не оказывал влияния на споры остальных грибов. Остальные соединения не препятствовали прорастанию спор. Только стагонолиды E и J были токсичны для злаковой тли, смертность тлей по сравнению с контролем составила около 60%. Так как фитотоксическая активность природных 10-членных лактонов была выражена в большей степени, чем другие типы активности, в исследованиях первого года проекта мы сосредоточились на анализе взаимосвязи структуры и фитотоксической активности. Фитотоксичные 10-членные лактоны S. cirsii (стагонолиды А, J, K и гербарумин I) различаются заместителями и конфигурацией при С-7 и С-8, а также конфигурацией С-9. Для выявления структурных особенностей, обуславливающих спектр и степень фитотоксической активности этих соединений, мы получили их полусинтетические окисленные и ацетилированные формы. Набор соединений из четырех природных и семи полусинтетических 10-членных лактонов тестировали на фитотоксическую активность в трех биотестах с использованием различных растительных моделей - методом надколотых листовых дисков осота полевого, в отношении проростков салата на водном агаре и против зеленых микроводорослей Hematococcus lacustris. Анализ полученных данных показал, что окисление С-7 гидроксигруппы до карбонильной приводит к резкому повышению фитотоксической активности в отношении надколотых листьев осота и проростков салата, а также к проявлению токсичности в отношении водорослей, бактерий и грибов. Профиль биологической активности в серии биотестов напрямую зависит от механизма действия вещества. Так, три использованных биотеста для определения фитотоксической активности четко показали различия в механизмах действия метрибузина (ингибитора фотосистемы II) и метсульфурон-метила (ингибитора ацетолактатсинтазы). Метрибузин оказался высокотоксичным для зеленых водорослей и листьев осота полевого, в то время как метсульфурон-метил показал высокую фитотоксичность в отношении проростков салата. Таким образом, C-7-окисленные 10-членные лактоны (стагонолид А, ацетилстагонолид А и С-7 окисленный стагонолид К) могут иметь механизм действия отличный от механизма действия остальных фитотоксинов S. cirsii.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
За второй год выполнения проекта в электронном виде была оформлена база известных природных 10-членных лактонов, которая содержит информацию о 202-х веществах, в том числе их тривиальные названия и характеристики структуры, а также данные об их биологической активности и природных источниках. Реализация базы в виде большой таблицы в формате Excel предоставляет возможность проводить статистическую обработку этой информации, группировать 10-членные лактоны исходя из их структурных особенностей, систематического положения продуцентов, биологической активности. При помощи метода рентгено-структурного анализа была пересмотрена конфигурация стереоцентров в молекуле курвулида А как 4S, 5S, 6R, 9R, что опровергает ранее предложенную в работе (Schmidt, Kunz, 2013) гипотезу о конфигурации атомов эпоксидного цикла. В процессе получения новых полусинтетических производных природных 10-членных лактонов были получены новые данные об особенностях протекания химических реакций с различными представителями класса. При эпоксидировании стагонолида Е, 7,8-диацетилгербарумина I и ацетилстагонолида Е 3-хлорпероксибензойной кислотой (реакция Прилежаева) было продемонстрировано, что итоговая конфигурация эпоксидного цикла объясняется не ориентирующим влиянием соседствующей гидроксильной группы (так называемым «эффектом Хэнбеста»), как было общепринято ранее, а стерическими факторами атаки перекиси на кратную углерод-углеродную связь. В ходе выполнения проекта было показано, что гидрирование 10-членных лактонов с помощью газообразного водорода в присутствии 5%-ного палладия ну угле в среде ТГФ с точки зрения хемоселективности протекало по трем основным направлениям: восстановление кратной С=С связи, изомеризация аллильных спиртов в насыщенные кетоны, раскрытие эпоксидного цикла (если он присутствует в структуре исходной молекулы). В библиотеку веществ для тестирования спектра биологической активности, как и в первый год выполнения проекта, вошли природные и полусинтетические представители класса. Стагонолиды A, J, K и гербарумин I, модифицированные по С-5-С-6 двойной связи (эпокси-производные и гидрированные производные) были интересны в первую очередь с точки зрения взаимосвязи структуры и фитотоксической активности. Производные стагонолида Е и курвулида А, а также разнообразные природные представители класса с метильной группой при С-9 интересны взаимосвязью структуры с инсектицидной, антигрибной и цитотоксической активностью. Суммарное количество 10-членных лактонов, протестированных в широком наборе биотестов за второй год выполнения проекта, составило 18 веществ. Анализ биологической активности библиотеки веществ, полученных во втором году выполнения Проекта, показал, что модификация С-5-С-6 двойной связи приводит к неоднозначным изменениям в фитотоксической активности полусинтетических производных гербарумина I, стагонолидов A и К. Дигидрогербарумин I, в отличие от эпоксигербарумина I, сохранил фитотоксическую активность, хоть она и несколько снизилась по сравнению с природным предшественником. В то же время эпоксистагонолид К, напротив, продемонстрировал фитотоксическую активность, сравнимую с активностью стагонолида К. К сожалению, продукт реакции гидрирования стагонолида К оказался нестабильным, поэтому его не исследовали в биотестах. Продукт гидрирования стагонолида А показал слабую фитотоксическую активность и отсутствие токсичности в остальных биотестах. Возможно, фитотоксическая активность этих веществ зависит от пространственной структуры С-5-С9 участка молекулы. Среди 10-членных лактонов с метильным заместителем при С-9 в нашу библитотеку входили три очень близких по структуре природных соединения, а именно стагонолид Е, его природный эпоксидированный аналог курвулид А, а также структурный изомер курвулида А по положению ОН-группы. Интересно, что каждое из этих веществ проявляет уникальный тип активности, который не свойственен остальным двум соединениям. Так, стагонолид Е токсичен для злаковой тли, курвулид А и его ацетильное производное - фитотоксичны, а новый изомер курвулида А проявляет цитотоксическую активность в отношении клеток Sf9. Помимо ацетильных производных стагонолида Е и курвулида А, в полученном наборе 10-членных лактонов нет других соединений, с которыми можно было бы сравнить биологическую активность этих веществ, чтобы однозначно определить структурные особенности, обуславливающие их инсектицидную, фитотоксическую и цитотоксическую активности. В ходе второго года выполнения Проекта на качественно новом уровне был проведен анализ данных, полученных в прошлом году. Была оценена антимикробная и цитотоксическая активность одиннадцати рассматриваемых за первый год природных и полусинтетических 10-членных лактонов, методом обращенно-фазовой ВЭЖХ определена липофильность (LogP) исследуемых веществ. Полученные данные были проанализированы и визуализированы при помощи метода главных компонент. Наблюдалась высокая корреляция между токсичностью веществ в различных биотестах - в отношении водорослей, бактерий и клеток Sf9. Липофильность веществ показала отрицательную корреляцию с результатами фитотоксичности на листовых высечках осота. Исследуемые вещества разделились на два кластера – в один попали вещества, имеющие кето-группу при С-7, а в другой – все остальные. Результаты изложены нами в публикации Dalinova et al., 2021. Более детальное изучение биологической активности пиренолида С показало, что профиль его токсичности схож с профилем токсичности стагонолида А. В их структурах имеется схожий набор функциональных групп, в частности кето-группа, сопряженная с кратной С-С связью. В первом году выполнения Проекта мы показали, то направленное окисление С-7 гидроксильной группы в молекуле стагонолида К до кето-группы приводит к такому же повышению побочной токсичности. В этом году мы показали, что восстановление С-5-С-6 кратной связи в молекуле стагонолида А ведет к потере побочной токсичности. Из полученных данных следует, что 10-членные лактоны с сопряженной кето-группой будут демонстрировать неспецифическую токсичность. С использованием нескольких физиолого-биохимических тестов мы показали контрастность эффектов стагонолида А и гербарумина I. Очевидно, что два родственных по структуре фитотоксина обладают совершенно разными механизмами действия. Многие природные токсины напрямую оказывают влияние на работу ФСII, например, через связывание с D1-белком (тенуазоновая кислота, патулин) (Chen et al., 2007; Guo et al., 2021). Наши результаты демонстрируют, что механизмы действия стагонолида А и гербарумина I затрагивают другие клеточные процессы в растительных клетках. Токсичность стагонолида А (как и цитологические изменения состояния обработанных тканей) проявляются уже в первые часы после обработки, маловероятно, что они обусловлены действием на биосинтез каких-либо важных компонентов клеток. Одним из вероятных механизмов действия может быть нарушение экспорта белков из эндоплазматического ретикулума (ЭР) и/или комплекса Гольджи, либо нарушение формирования везикул обмена между ЭР и комплекса Гольджи. В случае гербарумина I эффекты развиваются длительное время, поэтому можно предположить влияние на биосинтез пигментов, аминокислот, жирных кислот, компонентов клеточных стенок и т.д. Сходный эффект на OJIP-кинетики наблюдается при воздействии природных фитотоксинов макроцидинов, которые ингибируют биосинтез каротиноидов (Hubbard et al., 2016). К сожалению, полученные в ходе выполнения Проекта результаты пока что не позволяют сузить круг возможных механизмов действия гербарумина I.