Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Теломеры представляют собой физические концы эукариотических линейных хромосом, которые защищают их от прогрессирующего укорочения и ошибочного распознавания в качестве хромосомных разрывов. Интерес к биологии теломер главным образом вызван взаимосвязью между функциями теломер, механизмами старения организма и развитием различных заболеваний человека. Теломерная ДНК состоит из множества коротких нуклеотидных повторов. Известно, что определенное количество теломерных повторов, полученное при рождении, изначально предопределяет способность большинства соматических клеток к пролиферации (Prochazkova et al., 2019). Таким образом, начальная длина теломер — это наиболее аккуратный клеточный маркер биологического возраста. Несмотря на активное изучение биологии теломер, многие аспекты функционирования этой структуры и ее регуляции остаются неизвестными. В связи с этим, общей целью наших исследований является идентификация и детальное изучение молекулярных механизмов и генетических факторов, ответственных за установление видоспецифичной длины теломер. Одной из наиболее эффективных модельных систем для молекулярно-генетических исследований в данной области являются растения, в частности, модельное растение Arabidopsis thaliana (резуховидка Таля). Проведенные нами ранее предварительные эксперименты по изучению длины теломер в рекомбинантной инбредной популяции MAGIC Arabidopsis thaliana позволили идентифицировать ген, контролирующий длину теломер, OLI2/NOP2A (Abdulkina et al., 2019). Ранее ген OLI2/NOP2A был идентифицирован как часть генетического пути OLIGOCELLULA, контролирующего пролиферацию клеток (Fujikura et al., 2009). Несколько генов этого пути участвуют в биогенезе рибосом, в частности, гены OLI5/RPL5A и OLI7/RPL5B, которые кодируют высоко-консервативные варианты рибосомного белка L5, входящего в состав 60S субъединицы рибосомы. Нами также было показано участие этих генов в поддержании гомеостаза длины теломер (Abdulkina et al., 2019). Предположительно, генетический путь OLIGOCELLULA включает также и другие, ещё не идентифицированные гены, так или иначе задействованные в механизмах регуляции биологии теломер. Проведенные нами на первом этапе реализации Проекта эксперименты позволили идентифицировать несколько новых компонентов генетического пути OLIGOCELLULA, являющихся важными регуляторами длины теломер в модельном растении Arabidopsis thaliana. Так, нами было показано, что ген OLI1/HOS15 также является важным регулятором длины теломер. Более того, мы определили, что длина теломер мутантов oli1-2/hos15-3 увеличивается, в отличие от ранее изученных других генов пути OLIGOCELLULA (OLI2/NOP2A, OLI5/RPL5A и OLI7/RPL5B) и, в частности, установили, что удлинение теломер является «прогрессирующим», то есть наблюдаемым от поколения к поколению мутантов. Таким образом, установлено, что ген OLI1/HOS15 оказывает значительное влияние на установление правильной видоспецифичной длины теломер. Поскольку известно, что исследуемый ген OLI1/HOS15 кодирует белок, являющийся транскрипционным ко-репрессором, который регулирует устойчивость растений к холоду посредством деацетилирования гистонов в комплексе с белками гистондеацетилазой 2 (HD2С), гистондеацетилазой 9 (HDA9) и фактором транскрипции POWERDRESS (PWR) (Shen et al., 2020), нами были проведены эксперименты по исследованию роли этих белков в регуляции биологии теломер. В результате проведённой нами серии экспериментов было показано, что контроль длины теломер не является общим признаком для всех OLI1/HOS15-взаимодействующих генов, посокольку у мутантов по генам HD2С, HDA9 и PWR длина теломер оставалась на уровне дикого типа. Таким образом, установлено, что из всех изученных генов лишь OLI1/HOS15 вовлечён в регуляцию длины теломер. Для изучения возможной вовлеченности генов HD2С, HDA9 и PWR в защиту концевых участков хромосом от слипания, был проведён дополнительный цитогенетический анализ, позволяющий идентифицировать хромосомные аберрации. В результате цитогенетического анализа в клетках мутантных растений не наблюдалось геномных аберраций и других нарушений в ходе клеточного деления, что подтверждает наши данные о том, что теломерный фенотип является уникальным лишь для гена OLI1/HOS15. Был начаты исследования по изучению эпистаза гена OLI1/HOS15 и одного из других генов OLIGOCELLULA (OLI2/NOP2A) путём получения двойных мутантов. Были получены первое поколение F1 растений oli1-2 oli2-4, гетерозиготных по Т-ДНК вставке в обоих генах, а также второе поколение F2 двойных мутантов. Анализ сегрегации аллелей изучаемых генов в этом поколении проводится в настоящее время. После получения гомозиготных линий двойных мутантов по Т—ДНК вставкам будет проведено дальнейшее изучение их роли в биологии теломер. Был проведён поиск новых генов-кандидатов с помощью анализа экспрессии генов в растениях с мутациями в генах OLI. В результате транскриптомного анализа мутантов по генам OLI2/NOP2A, OLI5/RPL5A и OLI7/RPL5B, а также растений экотипов Col-0 и Sf-2, мы выявили кластеры генов с наибольшей вариабельностью экспрессии. Построенная на основании полученных данных смоделированная генная сеть указывает на активацию экспрессии генов клеточного цикла, хромосомной реорганизации, движения микротрубочек, биогенеза рибосом и деления ядра у различных мутантов OLIGOCELLULA. Эти эксперименты позволили обнаружить гены, экспрессия которых изменяется при инактивации индивидуальных компонентов генетического пути OLIGOCELLULA. На основании полученных данных в дальнейшем будут отобраны гены-кандидаты для молекулярно-генетического анализа их вклада в регуляцию длины теломер. Таким образом, на первом этапе выполнения исследований Проекта нами было установлено, что ген OLI1/HOS15, кодирующий белок деацетилазы гистонов, является ещё одним компонентом генетического пути OLIGOCELLULA, участвующим в регуляции длины теломер. На основании данных транскриптомики были обнаружены новые гены-кандидаты, ко-регулируемые с генами OLIGOCELLULA. Показано, что большинство генов-кандидатов также участвуют в биогенезе рибосом. Дальнейший анализ влияния эпистаза генов OLIGOCELLULA и обнаруженных новых генов на стабильность теломер позволит раскрыть их функции и выявить взаимосвязь между биологией теломер, биогенезом рибосом и влиянием стрессовых факторов окружающей среды.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Теломеры – это естественные концы эукариотических линейных хромосом, которые защищают их от прогрессирующего укорочения и ошибочного распознавания в качестве хромосомных разрывов. Теломерная ДНК состоит из множества коротких нуклеотидных повторов, совокупная длина которых видоспецифична. Известно, что определенное количество теломерных повторов, полученное при рождении, изначально предопределяет способность большинства человеческих соматических клеток к пролиферации [Prochazkova Schrumpfova et al., 2019]. Таким образом, длина теломер — это один из наиболее аккуратных маркеров биологического возраста клетки. Главная задача наших исследований - поиск и анализ генетических факторов, ответственных за установление и регуляцию видоспецифичной длины теломер с использованием в качестве объекта исследований модельного растения Arabidopsis thaliana. Проведенные нами ранее эксперименты позволили идентифицировать важный ген-кандидат OLI2/NOP2A, контролирующий длину теломер [Abdulkina et al., 2019]. Ген OLI2/NOP2A известен как часть генетического пути OLIGOCELLULA [Fujikura et al., 2009]. Ранее нами были найдены несколько других генов этого пути, которые также участвуют в регуляции длины теломер растений, в частности, гены OLI5/RPL5A, OLI7/RPL5B [Abdulkina et al., 2019] и OLI1/HOS15 [неопубликованные данные]. Проведенные на первом этапе реализации Проекта эксперименты позволили определить, что длина теломер мутантов oli1-2/hos15-3 увеличивается, в отличие от других ранее изученных генов пути OLIGOCELLULA (OLI2/NOP2A, OLI5/RPL5A и OLI7/RPL5B). В частности, было установлено, что удлинение теломер является «прогрессирующим», то есть теломеры увеличивались в длине от поколения к поколению мутантов. С помощью проведенных нами на втором этапе реализации Проекта экспериментов мы установили, что наиболее значимое увеличение длины теломер у мутантов по гену OLI1/HOS15 происходит в четвертом и более поздних поколениях гомозиготных мутантных растений. Дополнительно мы определили, что вклад гена OLI1/HOS15 в защиту хромосом от аберраций незначителен. Были инициированы исследования по изучению эпистаза гена OLI1/HOS15 и других генов OLIGOCELLULA, имеющих теломерный фенотип, путём получения двойных мутантов. Были получены первое поколение (F1) растений oli1-2 oli5-3 и oli1-2 oli7-2, гетерозиготных по Т-ДНК вставке в обоих генах, а также второе поколение F2 двойных мутантов. Анализ сегрегации аллелей изучаемых генов в этом поколении проводится в настоящее время. После получения гомозиготных линий двойных мутантов будет проведено дальнейшее изучение их совместной роли в биологии теломер. Проведенный анализ теломерных фенотипов других двойных мутантов (oli1-2 oli2-4) в нескольких поколениях показал, что оба гена обладают противоположным влиянием на гомеостаз длины теломер, причем каждый ген по отдельности является важным регулятором длины теломер растений. Был проведен детальный анализ аннотаций генов-кандидатов, идентифицированных с помощью транскриптомного анализа мутантных растений линий oli2-2, oli2-3, oli5-2 и oli7-2, а также растений дикого типа экотипов Col-0 и Sf-2. В результате было выбрано 6 генов, экспрессия которых значительно меняется одновременно у нескольких исследуемых мутантов. В ходе работы были получены нокауты по выбранным генам, осуществлен анализ длины теломер у гомозиготных по мутантному аллелю растений, а также проведен анализ слипания теломер у мутантов, имеющих измененный теломерный фенотип по сравнению с диким типом. Таким образом, в результате транскриптомного анализа и серии проведенных генетических и цитогенетических экспериментов нами были найдены новые гены, влияющие на регуляцию длины теломер и стабильность генома растений A.thaliana. Полученные результаты позволили раскрыть функции генов кластера OLIGOCELLULA, связанные с биологией теломер, а также идентифицировать новые компоненты этого генетического пути, которые контролируют установление необходимой длины теломер в клетках растений.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Теломеры – это важнейшие нуклеопротеиновые структуры, находящиеся на концах эукариотических хромосом. Теломерная ДНК состоит из коротких нуклеотидных повторов, длина которых видоспецифична. Определенное количество теломерных повторов предопределяет способность соматических клеток к пролиферации (Srinivas et al., 2020, приложение). Поддержание правильной длины теломер необходимо для выживания клеток. Укорочение теломер приводит к деградации ДНК, старению клетки и апоптозу. И наоборот, длинные теломеры присутствуют у раковых клеток, которые обеспечивают себе неограниченное количество делений (Greider and Blackburn, 1985, приложение). Долгосрочная цель нашего проекта - это идентификация и детальное изучение молекулярных механизмов и генетических факторов, ответственных за установление видоспецифичной длины теломер в модельном растении Arabidopsis thaliana (резуховидка Таля). Проведенные нами ранее эксперименты позволили идентифицировать гены кластера OLIGOCELLULA, как важные компоненты теломерного гомеостаза, контролирующие длину теломер растений A. thaliana. В частности, гены OLI2/NOP2A, OLI5/RPL5A и OLI7/RPL5B являются положительными регуляторами длины теломер (Abdulkina et al., 2019, приложение), а ген OLI1/HOS15 – отрицательным (первый год проекта, неопубликованные данные). Известно, что продукт гена OLI1/HOS15 вместе с белками гистондеацетилазой 2 (HD2С), гистондеацетилазой 9 (HDA9) и фактором транскрипции POWERDRESS (PWR) образуют корепрессорный комплекс, который участвует в деацетилировании гистонов (Shen et al., 2020, приложение). С помощью проведенных нами на третьем этапе реализации Проекта экспериментов, мы определили, что ген HD2C также обладает функцией поддержания длины теломер, причем является положительным регулятором, в отличие от гена OLI1/HOS15, кодирующего его белок-партнер. Однако фенотип мутанта hd2c-1 слабовыражен по сравнению с другими мутантами oligocellula. Анализ взаимодействия генов OLI1 и HD2C показал, что ген HD2C необходим для элонгации теломер у мутантов oli1-2, так как при отсутствии двух анализируемых генов, длина теломер опускается ниже даже одиночных мутантов hd2c-1. Дополнительно мы определили, что одновременная инактивация генов OLI1/HOS15 и HD2C не приводит к хромосомным повреждениям в геноме растений A. thaliana. Анализ взаимодействия генов кластера OLIGOCELLULA между собой показал, что гены OLI2/NOP2A, OLI5/RPL5A, OLI7/RPL5B в геноме A. thaliana, вероятно, находятся в одном и том же генетическом пути по влиянию на биологию теломер. И, напротив, положительные регуляторы длины теломер Arabidopsis (OLI2/NOP2A, OLI5/RPL5A, OLI7/RPL5B) и отрицательный регулятор OLI1/HOS15 в геноме растения являются генами, оказывающими противоположный эффект на длину теломер. Предположительно, это может быть обусловлено тем, что они входят в различные генетические пути регуляции биологии теломер. Однако, несмотря на важность генов OLI в геноме растения, одновременная инактивация противоположно действующих генов не приводит к существенным хромосомным аберрациям. Анализ влияния гена OLI1/HOS15 на активность теломеразы in vitro показал, что независимо от поколения мутантных растений, уровни активности теломеразы у мутантов oli1-2 были такими же, как у растений дикого типа. Таким образом, удлинение теломерной ДНК, наблюдаемое у мутантов, происходит не из-за увеличения активности фермента теломеразы. Данная гипотеза была подтверждена в результате проведенного скрещивания и анализа длины теломер двойных мутантов по генам OLI1/HOS15 и TERT (ген теломеразы), для которых было показано увеличение длины теломер по сравнению с одиночным мутантом tert. Таким образом, мы пришли к выводу, что ген OLI1/HOS15, вероятно, обладает функцией элонгации теломер независимо от теломеразы. Детальный анализ изменения длины теломер из поколение в поколение для генов, отобранных в качестве новых кандидатов, которые также влияют на биологию теломер растений в предыдущий отчетный период Проекта показал, что ген RPP2C, который кодирует 60S кислый рибосомный белок, и ген HRA1, кодирующий транскрипционный фактор, являются отрицательным регуляторами длины теломер растений A. thaliana. Причем длина теломер остается стабильной на протяжении трех последовательных поколений у обоих мутантов.