Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Работа по проекту проводилась в полном соответствии с заявленным планом по следующим направлениями: 1)Молекулярный дизайн и синтез новых триарилметильных и диамагнитных фторных меток: 2)Изучение структурных и динамических аспектов организации ДНК-белковых комплексов, принимающих участие в репарации ДНК. 3)Изучение кинетики раскрытия поврежденных пар в ДНК и ее роли в узнавании повреждений ферментами репарации. 4)Изучение механизмов непрямого узнавания поврежденной ДНК белками. 5) Изучение роли ионизируемых групп в каталитическом механизме ферментов репарации. 1. В соответствии с планом исследований были синтезированы фторсодержащие ТАМ 1,3,5, отличающиеся сравнительно короткими расстояниями между неспаренным электроном и атомом (атомами) фтора. Синтез тритила 1 предполагал предварительную активацию монокарбоновой кислоты 6 системой оксалил хлорид/ДМФА. Последующая реакция с амином 1.1 приводила к получению целевого ТАМ 1 с почти количественным выходом. Близкий подход был заложен в схему получения тритила 5, однако этапу этерификации предшествовала стадия перевода ТАМ 6 в форму хлорангидрида с использованием системы хлористый тионил/триэтиламин. Получение эфира 3 достигнуто нуклеофильным замещением атома брома в бензилбромиде 3.1 карбоксилатной формой 6. Проведены эксперименты ENDOR на синтезированных системах и сделан вывод о диапазоне расстояний, которые можно измерять таким методом. Возможность использования ENDOR в W-диапазоне с меткой 19F и ТАМ была исследована для синтезированных модельных соединений 1–5 и человеческом сывороточном альбумине (ЧСА), меченном ТАМ. Показано, что проведение экспериментов в сильных магнитных полей позволяет экспериментально разрешить резонансные линии от ядер 19F и протонов. Длительное время релаксации тритилов помогает увеличить задержки между импульсами в экспериментах Mims ENDOR. В отличие от нитроксидов, возможно получение спектров только в одном резонансном положении из-за низкой анизотропии g-фактора ТАМ и существенному сокращению времени необходимого для проведения экспериментов. Для всех модельных структур были зарегистрированы резонансные линии на частоте 19F в спектрах ENDOR W-диапазона. ТАМ имеет довольно большой размер, а электронная спиновая плотность распределена по π-системе радикала ТАМ, поэтому, мы провели подробный теоретический анализ применимости приближения точечных диполей к модельным системам ТАМ, меченным фтором. Было обнаружено, что можно рассматривать структуру тритильного радикала как сферическую для расстояний более 0,8 нм, тогда как для расстояний меньше 0,8 нм неоднородное распределение спиновой плотности приводит к неаксиальности дипольного тензора, что может влиять на полученные результаты при измерении расстояний, и должно быть учтено явно при анализе экспериментальных данных. Мы провели сравнение экспериментальных данных, полученных методами ENDOR и измерения ЯМР с усилением парамагнитной релаксации (PRE) для двух радикалов: 1 и 5. Для радикала 1 было невозможно оценить расстояние между центральным углеродом ТАМ и фтором из-за слишком высокого значения константы изотропного сверхтонкого взаимодействия на ядрах фтора, тогда как для радикала 5 расстояния, полученные обоими методами, хорошо согласуются с расстояниями, рассчитанными с помощью конформационного анализа. Более того, для радикала 5 в ENDOR мы наблюдали сигнал как от CF2, так и от CF2H-группы и получили усредненные расстояния, как в экспериментах PRE ЯМР. Мы применили разработанный метод для исследования тиольного обмена в человеческом сывороточном альбумине (ЧСА). Показано, что измерения ENDOR в W-диапазоне фторированного N-гомоцистеинилированного ЧСА позволяет исследовать процесс тиольного обмена между двумя белками. Анализ результатов , полученных методом ENDOR всех соединений подтвердил наличие обмена между молекулами ЧСА через дисульфидную связь и появление ЧСА, содержащего фторную метку и парамагнитный центр в одной и той же молекуле. Кроме того, эквивалентность трех остатков гомоцистеина в меченном фтором HSA была доказана с помощью спектроскопии ENDOR в W-полосе и HSA-OX063. Результаты синтеза включены в опубликованную обзорную статью: В. М. Тормышев, Е. Г. Багрянская, «Тритильные радикалы: синтез, свойства и применение» Известия Академии наук, Серия химическая, 2021, N 12, стр. 2278. По результатам разработки нового подхода к измерению расстояний в биомолекулах подготовлена статья и послана в журнал Physical Chemistry Chemical Physics (Q1). «Application of W-band 19F electron nuclear double resonance (ENDOR) spectroscopy to distance measurement using a trityl spin probe and a fluorine label, N.B. Asanbaeva, A.A. Sukhanov, A.A. Diveikina, O. Yu. Rogozhnikova, D.V. Trukhin , V.M. Tormyshev, A.S. Chubarov, A.G. Maryasov, A.M. Genaev, A.V. Shernyukov , G.E. Salnikov , А. A. Lomzov, D.V. Pyshnyi, E.G. Bagryanskaya» Статья находиться на рецензирование, а ее текст статьи находится в приложение. 2. Были изучены структурные и динамических аспекты организации некоторых ДНК-белковых комплексов, принимающих участие в репарации ДНК. Были синтезированы олигонуклеотиды с тетрагидрофурановым АП-сайт и метоксиаминовым производным АП сайта, и комплементарные спин-меченные олигонуклеотиды со спиновыми метками на основе нитроксильных и триарилметильных радикалов. Для установления структуры эндонуклеазы V хлореллавируса, проведен ряд экспериментов ЯМР в жидкости, которые сравнивались с литературными данными ЯМР в жидкости относительного похожего белка эндонуклеазы V бактериофага T4 (BMRB Entry 5244). Была использована схема изотопного обогащения включающая дейтерирование, из-за того, что выше 20°С раствор белка превращался в гель. Для эндонуклеазы V хлореллавируса был получен однородно изотопно-обогащенный образец [U-15N,13C] и получен спектр 15N-HSQC. Из анализа спектра сделан вывод о количестве пиков >160 (теоретическое с учетом сигналов от боковых цепей 174), дисперсия химических сдвигов которых соответствует упорядоченному белку. Таким образом, полученные на первом году выполнения проекта данные показывают перспективность дальнейшего изучения структуры с помощью ЯМР в жидкости и в настоящее время проводится оптимизация условий в образце для записи необходимых спектров. 3. В рамках изучения роли кинетики раскрытия поврежденных пар в ДНК в узнавании повреждений ферментами репарации, с помощью метода ЯМР в жидкости были проведены исследования на модельных ДНК дуплексах. Данные о скорости раскрытия-закрытия пар оснований в ДНК были получены, путем измерения скорости обмена имино протонов T и G с протонами воды в зависимости от концентрации катализатора обмена. Для измерения скорости обмена имино протонов с водой использовалась методика CLEANEX, в которой предусмотрена компенсация влияния внутримолекулярной кросс-релаксации и спиновой диффузии, а также подавления эффекта дампинга за счет интенсивного сигнала воды. Была изучена динамика раскрытия-закрытия пар oxoG:C и oxoG:A в контекстах с разным стэкингом для четырех самокомплементарных ДНК-дуплексов, для каждого из которых были определены температуры плавления. Динамика открытия - закрытия пар оснований ДНК изучалась посредством получения констант видимых скоростей обмена kex иминопротонов гуанозинов (G) и тимидинов (T) с водой в присутствии катализатора обмена. Из аппроксимации экспериментальных данных зависимостей I/I0 от τ уравнением (1) был получен набор величин kex при разных добавлениях DFEA. Катализатором обмена является осно́вная форма DFEA. Получены значения kopen, kclose, Keq для иминопротонов образцов C*AGG и A*AGG представлены в таблице 1. Значение Keq для иминопротона G образца A*CGT составило (Keq= 1.044±0.011 x 10-6) 4. Были проведены эксперименты DEER/PELDOR и измерены распределения расстояний между спиновыми метками, введёнными на концах ДНК для специфичной и неспецифичной ДНК методом импульсной ЭПР спектроскопии с использованием нитроксильных и тритильных спиновых меток для некоторых белков с дуплексами. Были синтезированы олигонуклеотиды спин-меченных метками ТАМ и олигонуклеотиды спин-меченные никтроксильными радикалами по 3’ и 5’ концам, а также комплементарные им олигонуклеотидов, содержащие различные молекулы, моделирующие повреждения в середине нуклеотидной последовательности. Методами импульсной ЭПР спектроскопии (PELDOR для нитроксил-меченных дуплексов и DQC для тритилмеченных дуплексов) были измерены расстояния между спиновыми метками, и их распределение. Из полученных данных видно, что наблюдается зависимость расстояний и их распределений от структуры повреждений. В настоящее время проводятся МД расчеты дуплексов и их комплексов с белками. Из сравнения экспериментальных данных и расчетов в следующем году будут сделаны выводы о структуре исследованных экспериментально комплексов при различных типах повреждения. 5. Для изучения роли ионизируемых групп в каталитическом механизме ферментов репарации был проведены подготовительные работы для синтеза ДНК дуплексов спин-меченных на 5'-конец ДНК спиновыми метками на основе имидазолиновых и имидазолидиновых нитроксильных радикалов, чувствительными к pH/электростатике и к близости молекул воды. Были синтезированы следующие метки: 3-амино-Проксил, 3-иодацетамидометил-2,2,5,5-тетраметил-2,5-дигидропирролин-1-оксил (IAM-TPO) (для присоединения по фосфатным остаткам), 3-(метансульфонилтио)метил-2,2,5,5-тетраметил-2,5-дигидропирролин-1-оксил MTSL, 2,2,5,5-тетраметил-3,4-бис-((метансульфонилтио)метил)-2,5-дигидропиррол-1-оксил (НО-1944) (для мечения «дикого» фермента), 3-этинил-2,2,5,5-тетраметил-2,5-дигидропирролин-1-оксил (ТРА), 14-этинил-7-азадиспиро[5.1.5.2]пентадецен-14-7-оксил (UTPA) (для жёсткого присоединения к нуклеотидам). Кроме того, для решения задач проекта были разработаны новые рН-чувствительные спиновые метки, принимая во внимание особенности исследуемых систем. С целью введения pH-чувствительных ЭПР-меток в ДНК и дальнейшего исследования с их помощью состояний ионизации активного центра ферментов были синтезированы олигонуклеотиды, несущие на 5′- или 3′-конце остатки гексиламина для последующей конъюгации с ЭПР-метками. Последовательности модифицированных и комплементарных олигонуклеотидов подбирались исходя из известных структур ДНК-гликозилаз бактерий (Fpg, Nei) и человека (NEIL1, NEIL2) с тем, чтобы конъюгированная группа располагалась в активном центре или в непосредственной близости от него. Были получены препараты ферментов Fpg, Nei, NEIL1 и NEIL2 как дикого типа, так и несущие универсальную для них инактивирующую аминокислотную замену Glu2→Gln. В литературе предполагается, что Glu2 выступает в реакциях, катализируемых данными ферментами, как донор протона, и исследование зарядового состояния этого остатка является одной из основных целей данной части проекта. В настоящее время проводится исследование связывания указанных белков с собранными олигонуклеотидными дуплексами методом микроскопического термофореза. В 2022 году планируется введение спиновых меток и измерения методом ЭПР-спектроскопии, на основание чего будут сделаны выводы о роли ионизируемых групп в каталитическом механизме ферментов репарации. По результатам синтеза отправлена статья в журнал Gels (Q1). “4-Dialkylamino-2,5-dihydroimidazol-1-oxyls with Functional 2 Groups at the Position 2 and at the Exocyclic Nitrogen: The pH- 3 Sensitive Spin Labels., Dmitrii G. Trofimov , Yuri I. Glazachev , Artem A. Gorodetsky, Denis A. Komarov, Tatyana V. Rybalova, Igor A. Kirilyuk. Статья находится на рецензирование и ее текст статьи приведен в приложение.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
1.Нам удалось расширить круг тритилсодержащих реагентов, предлагаемых для спинмечения олигонуклеотидов. Синтезированы две новые спиновые метки: Finland и OX063, полученные из соответствующих тритилов, вводимых в реакцию форме трикислот. Показана их высокая эффективность в сайт-направленном спин-мечении олигонуклеотидов, модифицированных введением пиперазинового заместителя по 5’-концам. Введение двух новых ТАМ обеспечивает высокую эффективность спин-мечения, дополненную простотой работы с этими высокоустойчивыми реагентами. 2. Методом 19F ENDOR спектроскопии исследована структура и динамика 20-мерных ДНК дуплексов, состоящих из дезоксирибонуклеотида (Fin-DNA20 или OX063-DNA20), меченный TAM (Финский тритил-Fin или OX063) на 5’-конце и комплиментарного олигонуклеотида, с 2’-фтормодифицированным нуклеотидом на 3’-конце. 2'-Фтормодифицированный нуклеотид вводили в первое или второе положение от 3'-конца олигонуклеотида 2 (F1 и F2). Путем анализа полученных экспериментальных данных получены расстояния между центром ТАМ и атомами фтора, а также распределения этих расстояний. Полученные результаты были представлены Phys. Chem. Chem. Phys. 2022, 24, 5982–6001. 3. Нитроксиды имидазолина являются наиболее часто используемыми рН-чувствительными спиновыми зондами и метками благодаря высокой чувствительности параметров спектров ЭПР к изменению рН, их малым размерам и хорошо разработанной химии. Нами синтезировано несколько новых производных 4-(N,N-диалкиламино)-2,5-дигидриоимидазол-1-оксила с функциональными группами, подходящими для специфического связывания. Исследована зависимость параметров их спектров ЭПР от рН. Некоторые из них показали pKa, близкую к 7,4, после изменения pH в нормальном физиологическом диапазоне, а некоторые продемонстрировали монотонное изменение константы сверхтонкого взаимодействия на 0,14 мТл при изменении pH на четыре единицы. Полученные результаты опубликованы в статье Gels, 2022. 11; https://doi.org/10.3390/gels8010011 4. 8-оксо-7,8-дигидрогуанин (oxoG) - это обширное повреждение ДНК, которое может соединяться с аденином и вызывать мутации. Чтобы предотвратить это, клетки обладают гликозилазами для репарации ДНК, которые либо удаляют оксоГ из пар оксоГ:С (бактериальная Fpg, человеческая OGG1), либо удаляют А из пар А:оксоГ (бактериальная MutY, человеческая MUTYH). Ранние этапы распознавания повреждений остаются туманными: предполагалось, что ферменты либо принудительно открывают пары оснований, либо захватывают повреждение в спонтанно открытой паре. Здесь мы модифицируем протокол ЯМР CLEANEX-PM для обнаружения обмена иминопротонов ДНК и анализируем динамику пар oxoG:C и oxoG:A и их неповрежденных аналогов в нуклеотидных контекстах с различной энергией укладки. Даже в условиях плохой укладки пара oxoG:C открывалась не легче, чем G:C, что свидетельствует против захвата внеэлитных оснований Fpg/OGG1. Напротив, oxoG напротив A значительно заселял экстрахелическое состояние, что может способствовать распознаванию MutY/MUTYH. Наши результаты являются значимыми для понимания механизма поиска повреждения 8-оксогуанина гликозилазами ДНК. Маловероятно, что oxoG в паре с C подвергается захвату гликозилазы, будучи вывернутым из спирали ДНК, так как пара oxoG:C является даже более стабильной, чем пара G:C. Таким образом, OGG1 и FPG должны активно задействовать свои метастабильные конформеры для инициации выворачивания oxoG из спирали ДНК в активные сайты ферментов. С другой стороны, oxoG оказывается более доступным во внеспиральном положении, когда находится напротив A по сравнению с C. Это наблюдение согласуется с литературными данными, что для распознавания oxoG ферментом MutY не важно ни наличие дуплекса, ни наличие пары oxoG:A, что подтверждает механизм внеспирального распознавания 8-оксогуанина ферментом MutY. Таким образом, мы предполагаем, что ключевым этапом раннего распознавания 8-оксогуанина ферментами MutY/MUTYH, но не ферментами FPG/OGG1, может являться его захват во внеспиральном положении. По результатам этих исследований подготовлена статья и находится на рецензирование в журнале JACS. 5. Ранее группа исследователей из ИХБФМ СО РАН и НИОЦ СО РАН обнаружила соединения, ингибирующие in vitro активность человеческого рекомбинантного белка Tdp1. Одним из наиболее эффективных ингибиторов Tdp1 является гидразонотиазольное производное усниновой кислоты OL9-119. Это соединение проявило in vitro на клеточных культурах значительный сенсибилизирующий эффект цитотоксического действия топотекана, ингибитора Tor1, используемого в клинике для лечения рака. Кроме того, было обнаружено, что OL9-119 усиливает противоопухолевое и антиметастатическое действие топотекана in vivo. Мы провели эксперименты по установлению деталей механизма взаимодействия этого фермента в комплексе фермент-ДНК-субстрат-OL9-119 методом ЭПР. Для проведения ЭПР-исследований в структуру фермента была введена спиновая метка, содержащая нитроксильный радикал, а структура ингибитора OL9-119 была модифицирована парамагнитной медью. В работе использовалась усеченная версия белка Tdp1, Δ148Tdp1, представляющая собой фермент, удаленный с N-конца на 148 нуклеотидных остатков, с сохранением каталитического домена, для которого была получена кристаллическая структура с тремя цистеиновыми остатками. 6. Осуществлён синтез ДНК олигонуктеотидов спин-меченных на 5'-конец ДНК спиновыми метками на основе имидазолиновых и имидазолидиновых нитроксильных радикалов, чувствительных к pH / электростатике и к близости молекул воды, с использованием нитроксильных радикалов. Были измерены зависимости ЭПР спектров при разных рН для спиновых меток, для спин-меченных ДНК дуплексов с повреждением и для комплексов дуплексов с ферментом. Сравнение калибровочных кривых спин-меченного амина в олигонуклеотиде в свободном состоянии или же в дуплексе ДНК, показывает, что диапазон чувствительности метки к pH слегка сдвигается в сторону бо́льших значений pH, и наибольшая чувствительность метки в этом случае достигается в диапазоне 6-7.5 ед. pH. Для всех трёх калибровочных кривых величина pKa является одинаковой, а диапазон изменения рН для свободной метки на 0.4 Гс больше чем для спин-меченного олигонуклеотида NO5’ и дуплексов. В спектрах ЭПР дуплексов с ферментом проявилась спектральная компонента, относящаяся к очень малоподвижной спиновой метке, что свидетельствует об образование комплекса FPG+comp23NO5’. Проведено моделирование полученного спектра в предположение медленного изотропного вращения спиновой метки при времени корреляции изотропного вращения спиновой метки τс = 11 нc, что хорошо согласуется с оценкой, сделанной для изотропного вращения FPG (1K82 PDB) и FPG+дуплекса по формуле Стокса-Эйнштейна. Для дальнейших экспериментов и получения информации о рН в комплексе необходимо обеспечить преимущественный вклад в сигнал от комплекса. Вследствие низкой мобильности комплекса ширины линий в спектре ЭПР слишком большие и в Х-диапазоне будет сложно с высокой точностью определить рН по спектрам ЭПР. Поэтому принято решение после оптимизации образца провести эксперименты в W-диапазоне в более высоких магнитных полях, в Казанском физико-техническом институте имени Завойского. Договоренность об этом имеется. После оптимизации концентрации фермента FPG и компонент дуплекса будут проведены эксперименты ESEEM для определения окружения спиновой метки. Такие эксперименты будут проведены в замороженном дейтерированном и протонированном растворах. По результатам работы планируется написание статьи в высокорейтинговый журнал.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Сведения о достигнутых конкретных научных результатах в отчетном периоде (от 1 до 5 стр.) 1. Синтезированы спиновые метки на основе триарилметильных радикалов для ковалентного связывания с белками и олигонуклеотидами и отработаны новые способы введения триарилметильных меток в олигонуклеотиды. Разработаны методики синтеза спиновых меток на основе триарилметильных радикалов с обогащением по 13С. Синтезированные радикалы оказались очень эффективными не только в качестве спиновых меток, но также и в качестве поляризующих агентов для динамической поляризации ядер. По результатам опубликовано три статьи с благодарностью гранту: Ж.Орган. химии,2023, 59, № 6, 790-796; ХИУР. 2023, 31, 678-684; JACS, 2023, 145, 18, 10268-10274 . 2. Синтезированы новые спиновые метки на основе нитроксильных радикалов с жестким коротким линкером с возможностью их ковалентной пришивки к биополимеру по двум положениям и обеспечивающим отсутствие мобильности метки, и позволяющие исследовать динамику протеинов. Разработан метод асимметричной модификации ранее полученного 3,4-бис-(бромметил)-2,2,5,5-тетраэтил-3-пирролин-1-оксила (1), полученного нами ранее. 3. Методом 19F ENDOR (ДЭЯР) спектроскопии исследована структура и динамика 20-мерных ДНК дуплексов, меченных TAM на 5’-конце и с 2’-фтормодифицированным нуклеотидом на 3’-конце комплементарного олигонуклеотида. Экспериментально получены значения расстояний между центром ТАМ и атомами фтора. Распределения этих расстояний сравнены с результатами расчетов МД-моделирования. Показано, что для дуплексов, содержащих на конце пару А-U (для обоих типов меток ТАМ) спектры, рассчитанные без учета расплетения концов дуплекса, лучше согласуются с экспериментальными спектрами. Для дуплексов с концевой парой А-Т расчет с учетом структур с расплетёнными концами лучше коррелируют с экспериментальными спектрами. Короткие расстояния между метками, необходимые для более полного описания всего экспериментального спектра, могут быть получены только при расплетении дуплекса. Результаты представлены [Phys. Chem. Chem. Phys., 2023, 25(35), 23454-23466]. 4. Тирозил-ДНК-фосфодиэстераза 1 (Tdp1) – фермент репарации ДНК, который удаляет с 3'-конца цепи ДНК ковалентные комплексы ДНК-топоизомераза 1 (Top1). Методом импульсной ЭПР спектроскопии исследована структура тройного комплекса рекомбинантного белка человека Tdp1–ДНК-субстрат–OL9-119. Осуществлен синтез олигонуклеотидных субстратов, имитирующих природный субстрат Tdp1 и содержащих тритильную ЭПР метку на 3'-конце. Показано, что Tdp1 способна узнавать их в качестве субстрата, но при этом не гидролизовать 3'-модифицированный конец, то есть метка сохраняется в составе олигонуклеотида-субстрата. Результаты метода ЭПР-спектроскопии показали, что основной пик в распределении по расстояниям между нитроксильной и тритильной метками расположен на 2.7 нм, что свидетельствует о сближении спин-меченного цистеина в белке и 3'-конца ДНК в комплексе. Распределение по межспиновым расстояниям не изменяется при добавлении ингибитора. Таким образом, соединение OL9-119, обладая высокой ингибирующей активностью, не препятствует связыванию фермента с ДНК и не влияет на структуру надмолекулярного комплекса. После проведения МД-расчетов по результатам исследований будет подготовлена статья в NAR. 5. 8-Оксо-7,8-дигидрогуанин (oxoG), повреждение ДНК, может неправильно спариваться с аденином и вызывать мутации. Чтобы предотвратить это, клетки обладают гликозилазами репарации ДНК, которые вырезают либо oxoG из пар oxoG:C (бактериальный Fpg, человеческий OGG1), либо A из неправильных пар oxoG:A (бактериальный MutY, человеческий MUTYH). Ранние этапы распознавания повреждений остаются неясными и могут включать принудительное открытие пары оснований или захват спонтанно открытой пары. Используя адаптированный протокол ЯМР CLEANEX-PM для обнаружения имино-протонного обмена ДНК, мы проанализировали динамику oxoG:C, oxoG:A и их неповрежденных аналогов в нуклеотидных контекстах с различной энергией стэкинга. Даже в контексте плохого стэкинга пара oxoG:C открывается не легче, чем G:C, что свидетельствует против внеспирального захвата оснований с помощью Fpg/OGG1. Напротив, oxoG напротив A значительно заселил внеспиральное состояние, что может способствовать распознаванию MutY/MUTYH. По результатам опубликована статья JACS, 2023, 145, 10, 5613-5617. Додекамер Дрю–Дикерсона (ДДД) относится к одному из известнейших дуплексов ДНК. Он достаточно хорошо изучен разными структурными методами и является эталоном для разработки новых экспериментальных методик и молекулярно-механических силовых полей. Результаты метода дисперсии ядерной спиновой релаксации R1r для иминопротонов ДДД показали, что динамические процессы с характерными временами в милли-микросекундном масштабе не наблюдаются для всех комплементарных пар оснований, кроме предконцевых и концевых, вплоть до температуры 300 К. При этом динамика предконцевой G2 C11 пары сильно отличается, что приводит к намного большему времени жизни открытого состояния пары. Эти данные дополняют информацию о динамике комплементарных пар оснований, полученную ранее методом переноса намагниченности с воды за счет обмена, и делают картину наблюдаемых процессов в ДДД, связанных с процессом открытия-закрытия пар оснований в ДНК, более полной. По результатам опубликована статья в журнале ХИУР, 31 (2023) 665–670 6. Методом многомерной ЯМР спектроскопии была исследована динамика остова неповрежденной и поврежденной ДНК, содержащей метоксиаминовое производное АП сайта. Синтезированы дуплексы олигонуклеотиов, моделирующие неповрежденную и поврежденную ДНК, содержащую метоксиаминовое производное АП сайта, и получен ЯМР-образец дуплекса, состоящий из олигонуклеотидных цепей: 5'-CGCGAUACGCC-3' и 5'-GGCGTCTCGCG-3' и содержащий в центре неправильную пару C-U . Зарегистрированы спектры ЯМР в системах H2O+D2O (в том числе 2D 1H-1H NOESY, TOCSY) и D2O (в том числе 2D 1H-1H NOESY, TOCSY, 1H-31P-COSY, HSQC, 1H-13C-HSQC). Показано, что за исключением неправильной пары C-U, находящейся в середине дуплекса, все основания связаны по каноническому Уотсон-Криковскому типу. Из температурной зависимости спектров сделан вывод о том, что пары C-G, находящиеся между концевыми парами и парами AT, являются прочными и образуются стабильные спирали B-типа. Обнаружено, что часть сигналов особенно C-U и близлежащих пар сужаются при повышении температуры, что свидетельствует о наличие быстрого обмена между структурами, за счет процесса протекающего в центральном фрагменте, который содержит неправильную пару C-U. Отнесение сигналов в спектрах ЯМР и извлечение структурных ограничений, для последующего молекулярного моделирования будет закончено в 2024 году. 7. Методом ЭПР измерены pH в активном центре фермента с применением pH-чувствительной спиновой метки . Получены спектры ЭПР спиновой метки в её протонированном и депротонированном состоянии при 80 К в W-диапазоне. Измерены рН-зависимости спин-меченных олигонуклеотидов, дуплексов и комплексов спин-меченных дуплексов ДНК с одним и двумя разрывами белками Fpg (дикого типа или мутанта E2Q). Методом ESEEM изучена доступность спиновой метки в активном центре путем сравнения в дейтерированной воде для свободного дуплекса и в комплексе в Fpg и Fpg с мутацией E2Q. Обнаружено, что в случае дуплекса с разрывом в 2 нуклеотида зависимость спектра ЭПР от pH для комплекса Fpg дикого типа совпадает с аналогичным для комплекса Fpg с мутацией E2Q, а для дуплекса с разрывом в 1 нуклеотид зависимость спектра ЭПР от pH отличается. Поскольку различие между этими образцами комплексов лежит лишь в замене остатка глутаминовой кислоты (Glu2) на остаток глутамина (Gln2), то и наблюдаемое различие в профилях pH-зависимости спиновой метки связано с разным поведением N-концевого дипептида Pro1–Glu2(или Gln2) от pH. Причины обсуждаются и будут сравнены с МД расчётами. По результатам исследования подготовлена статья и будет послана в печать в ближайшее время.