Аннотация результатов, полученных в 2021 году
В данной работе предложено объединить свойства полимеров и наночастиц при создании стабильных многослойных покрытий стенок кварцевого капилляра для селективного электрофоретического разделения биологически активных соединений. В качестве наночастиц на неорганической основе выбраны цитрат-стабилизированные частицы золота (НЧЗ). Их сочетание с положительно заряженными полиэлектролитами (полидиаллилдиметиламмоний хлорид (ПДАДМАХ), полиэтиленимин (ПЭИ), поли-L-лизин (ПЛЛ)) обеспечило разделение как основных, так и кислотных аналитов. При этом полимер выступает как в качестве связующего слоя для обеспечения сорбции наночастиц на поверхности кварца, так и в качестве функционального слоя. Другой вариант модификаторов – наноразмерные иониты на основе сополимера стирола и дивинилбензола с терминальными сульфо- (НИК) и четвертичными аммонийными группами (НИА). Они не требуют дополнительной функционализации полимерами, и могут быть также использованы при создании многослойных стабильных покрытий для анализа биологически активных соединений. В рамках проекта разработаны условия формирования двухслойного покрытия на основе наноионитов, где функцию связующего слоя выполнял наноанионит, а функционального – нанокатионит. Покрытие стабильно в диапазоне рН 2-10. В случае двухслойного покрытия, где роль внешнего слоя выполняет нанокатионит, наблюдался независимый от рН катодный ЭОП: плотный первый слой на основе наночастиц (НИА) блокирует большую часть силанольных групп; второй слой (НИК) характеризуется также высокой плотностью и экранированием положительно заряженных терминальных групп первого модификатора собственными отрицательно заряженными сульфо-группами. Покрытия охарактеризованы СЭМ-снимками капилляров, независимо подтверждающие наличие покрытия и демонстрирующие их различную плотность. В отличие от однослойного покрытия на основе НИК, двухслойное - отличается высокой стабильность и не требует наличия модификатора в составе ФЭ. Показано, что возможно проводить до 120 анализов без обновления покрытия: СКО времен миграции аналитов на НИА-НИК покрытии <2% (n = 120), CКО площадей пиков аналитов <1.5% (n = 120). Определение катехоламинов и аминокислот на НИА-НИК двухслойном покрытии характеризуются высокими значениями параметров эффективности и селективности (N = 450 – 720 тыс т.т./м; Rs = 0.9-2.0 для катехоламинов; N = 400 – 520 тыс т.т./м; Rs = 1.0 – 1.3 для аминокислот). Кроме того, отмечено заметное снижение времени электрофоретического определения аналитов по сравнению с НИК-модифицированным и немодифицированным капилляром, что связано с большей величиной катодного ЭОП, сонаправленного с миграцией аналитов. Однако большое количество противоположно заряженных групп на поверхности капилляра негативно сказалось на форме пиков наиболее оснὸвных аналитов – Trp (N = 140 т.т./м) и MTA (N = 400 т.т./м) и привело к снижению селективности разделения в таких парах аналитов как MTA/NE и Trp/DOPA. На модифицированных наноионитами капиллярах опробованы различные варианты он-лайн концентрирования, наиболее эффективными из которых оказались стэкинг с усилением поля и электростэкинг. Стэкинг с усилением поля оказался более эффективным для однослойного покрытия: достигнутые факторы концентрирования (SEFh) в 1.3 раза меньше для НИА-НИК модифицированного капилляра. Для двухслойного покрытия увеличения объема вводимой пробы сопровождалось размыванием и перекрыванием зон аналитов. Причиной этого может бὸльшая концентрация активных центров на поверхности капилляра и более сильное взаимодействие аналитов с модификатором. Примнение электростэкинга наоборот позволило снизить ПО катехоламинов и аминокислот в 2-8 раз в случае двухслойного покрытия по сравнению с однослойным НИК-модифицированным капилляром. Показано, что в случае НИА-НИК покрытия, характеризующегося большим количеством функциональных сульфо- групп на поверхности капилляра, к общему механизму концентрирования, присущему электростэкингу, добавляется концентрирование за счет взаимодействия аналита с функциональными центрами поверхности капилляра. Исследованы возможности создания полислойных покрытий на основе цитра-стабилизированных наночастиц золота, испольщуемых совместно с положительно заряженными полиэлектролитами: поли(диаллилдиметиламмоний) хлорид (ПДАДМАХ) и поли(этиленимин) (ПЭИ). Цитрат-стабилизированные наночастицы золота (НЧЗ) синтезированы цитратным способом по методу Фримена используются в данной работе. Наночастицы охарактеризованы методами просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ), спектрофотометрии, а также был измерен их дзета-потенциал. Полученные частицы имеют диаметр D = 12±3 нм, что было также подтверждено ПЭМ-изображениями НЧЗ. Дзета потенциал поверхности наночастиц равен –44.1 мВ. В ходе выполнения проекта также получены НЧЗ, поверхностно модифицированные ПЭИ. НЧЗ-ПЭИ за счет положительного заряда (протонирование амино- групп PEI) осуществляли перезарядку поверхности капилляра, в результате чего регистрировался анодный ЭОП. Однако, покрытие оказалось чувствительным к природе противоиона, что приводило к резкому снижению величины ЭОП при использование многоосновных кислот в качестве основных компонентов фонового электролита (например, фосфатный буферный раствор). Покрытие было применено для анализа катехоламинов и белков. Покрытие способствовало разделению и концентрированию аналитов, что особенно важно в случае основных белков, которые в отсутствие модификатора необратимо сорбируются на поверхность капилляра. Достигнутые эффективности белков без применения техник он-лайн концентрирования составили 50-150×103 т.т./м. Кроме того покрытие апробировано и при одновременном анализе положительно и отрицательно заряженных аналитов при разработке методики разделения нейромедиаторов (эпинефрин, норэпинефрин, метанефрин и норметанефрин) и их метаболитов (гомованилиновая кислота, ванилилминдальная кислота). Для создания многослойных покрытий с использованием наночастиц золота и ПДАДМАХ последовательно оптимизированы условия формирования каждого из слоев. В результате формирования первого слоя (ПДАДМАХ) наблюдался быстрый обращенный ЭОП, свидетельствующий о перезарядке поверхности. Рабочий диапазон покрытия составлял от 2 до 6. Проведена дальнейшая модификация капилляра цитрат-стабилизированными наночастицами золота. Наибольший электроосматический поток на нормальной полярности удалось достичь при промывке капилляра сразу наибольшей концентрацией наночастиц. Полученные двухслойные покрытия ПДАДМАХ-НЧЗ с внешним функциональным слоем наночастиц золота охарактеризованы СЭМ-снимками, подтверждающими наличие плотного слоя наночастиц золота на поверхности (толщина слоя порядка 28 нм). Обнаружено, что использование ацетатных буферных растворов на полученном двухслойном покрытии приводит к постепенному замедлению катодного ЭОП, что можно объяснить заменой лиганда на поверхности наночастиц золота. Сформирован третий слой ПДАДМАХ. Покрытие апробировано при анализе катехоламинов, аминокислот и карбоновых кислот. Использование в качестве третьего слоя поли-L-лизина приводит к обращению ЭОП в кислой среде, однако, в щелочной среде наблюдался нормальный катодный ЭОП, что свидетельствует о неполноте сформированного покрытия. На трехслойных покрытиях с НЧЗ и внешним ПДАДМАХ-функциональным слоем проведен электрофоретических анализ катехоламинов и аминокислот, демонстрирующий разделение четырех аминокислот и увеличение селективности разделения по сравнению с монослоем. Показано, что остаточные свободные для взаимодействия НЧЗ способны к специфическим взаимодействиям с аналитами, что особенно проявляется в случае высокоосновного триптофана. Таким образом, в зависимости от степени насыщения поверхности НЧЗ функциональным слоем полимера, покрытие может быть применено для разделения различных типов аналитов.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
В ходе выполнения второго этапа работ по проекту разработаны новые трехслойные покрытия на основе поли(диаллилдиметиламмоний хлорида) (ПДАДМАХ) и цитрат-стабилизированных наночастиц золота (цНЧЗ). Наночастицы золота синтезированы цитратным способом и характеризовали методами ПЭМ и спектрофотометрии (диаметр D = 12 ± 3 нм, дзета-потенциал поверхности –44.1 мВ). Оптимизированы условия формирования связующего слоя ПДАДМАХ и второго слоя на основе цНЧЗ на внутренней поверхности капилляра. Двухслойное покрытие стабильно во всем диапазоне исследованных рН фоновых электролитов (2−10). Формирование функционального слоя ПДАДМАХ на поверхности ПДАДМАХ-НЧЗ-покрытия осуществляли аналогично первому слою ПДАДМАХ. Показано, что в отличие от однослойного ПДАДМАХ-покрытия, µЭОП трехслойного покрытия уменьшается с увеличением рН фонового электролита во всей изучаемой области рН. Это указывает на формирование неплотного функционального слоя ПДАДМАХ, оставляющего доступной цитратную оболочку НЧЗ, которая, в свою очередь, вносит вклад в изменение ЭОП при увеличении рН фонового электролита. Все полученные покрытия охарактеризованы СЭМ-изображениями, демонстрирующими наличие плотного, равномерного покрытия НЧЗ на внутренней поверхности капилляра. В среднем размер частиц на поверхности соответствует размеру НЧЗ, используемых для модификации (13 ± 2 нм). Аналитические возможности трехслойного покрытия ПДАДМАХ-НЧЗ-ПДАДМАХ оценивали при анализе анионных аналитов – 16 карбоновых кислот (щавелевая, муравьиная, винная, яблочная, кетоглутаровая, лимонная, ацетоуксусная, янтарная, молочная, уксусная, -гидроксимасляная, пропионовая, масляная, валериановая, изовалериановая, капроновая). Лучшая селективность разделения аналитов в парах яблочная/кетоглутаровая, янтарная/молочная, масляная/валериановая кислоты достигается именно при использовании трехслойных покрытий с НЧЗ. Для всех 16 компонентов смеси достигнуто разделение, в то время как для однослойного ПДАДМАХ-покрытия удалось детектировать только 13 пиков аналитов. Предположительно, основной механизм взаимодействия аналитов и НЧЗ – динамический обмен между цитрат-анионами поверхности НЧЗ и аналитами. Для снижения ПО метода произведена модификация классических условий стэкинга с усилением поля, заключающаяся в создании внутри капилляра зоны с низкой электропроводностью за счет введения водной «пробки». Степени концентрирования (SEFh) составили 30 единиц, ПО снижены в 20 раз и достигли значений 30-50 нг/мл. Разработанные условия концентрирования применены для капилляров с трехслойным покрытием на основе НЧЗ при анализе реального объекта – сыворотки крови мышей с моделью воспалительного заболевания кишечника. В работе предложены и сопоставлены два варианта формирования многослойных покрытий на основе бычьего сывороточного альбумина (БСА) с использованием цНЧЗ для увеличения удельной поверхности покрытий и ПДАДМАХ в качестве связующего слоя, обеспечивающего сорбцию модификаторов на стенках капилляра. Наночастицы золота, модифицированные альбумином, готовили из цНЧЗ путем смешения растворов наночастиц и альбумина и перемешивания в течение 12 ч при комнатной температуре. Концентрирование и очистку полученных цНЧЗ-БСА от избытка альбумина проводили при помощи центрифугирования. Смещение полосы поглощения модифицированными частицами в УФ-области спектра по сравнению с исходными цНЧЗ, а также значительное снижение дзета-потенциала поверхности независимо свидетельствуют об осуществлении реакции. Условия формирования связующих слоев на основе ПДАДМАХ и ПЛЛ взяты из предыдущих исследований. Формирование слоев на основе цНЧЗ-БСА осуществлялось путем промывки капилляра неразбавленными суспензиями наночастиц. СЭМ-снимки внутренней поверхности капилляров демонстрировали наличие неплотного слоя частиц на поверхности. Недостаточное количество хирального селектора на поверхности капилляра стало причиной отсутствия разделения энантиомеров триптофана без дополнительной добавки альбумина в состав ФЭ. Более перспективным оказался способ получения покрытий, основанный на послойном нанесении модификаторов. Капилляр последовательно промывали раствором ПДАДМАХ и цНЧЗ, в результате чего формировалось двухслойное плотное покрытие, чему способствовало наличие высокого дзета-потенциала поверхности цитрат-стабилизированных наночастиц золота. Этап формирования следующего слоя включал внутрикапиллярную постфункционализацию альбумином, для чего в капилляр вводили раствор БСА в фосфатном буферном растворе рН 7.4 и оставляли минимум на одну ночь. Для данного покрытия gри рН < pI наблюдается анодный ЭОП, а при рН ˃ pI наблюдается катодный ЭОП. Нулевое значение µЭОП наблюдалось при рН, равном или близким к значениям pI альбумина. Это подтверждает наличие плотного слоя альбумина на поверхности капилляра. Покрытие оказалось стабильным во всем исследуемом диапазоне рН (2-10). СЭМ-снимки внутренней поверхности полученного капилляра доказали получение плотного равномерного слоя наночастиц золота на поверхности. Применение данных капилляров позволило существенно снизить количество БСА, вводимого в ФЭ для достижения разделения энантиомеров триптофана: разрешение энантиомеров начинает фиксироваться при введении 5 мкМ БСА. Достигнутое в данной работе снижение концентрации БСА указывает на повышение количества активных центров на поверхности капилляра за счет использования НЧЗ и получения покрытий с высокой удельной поверхностью. В целях увеличения плотности и емкости покрытий получено пятислойное покрытие на основе ПДАДМАХ и цНЧЗ с чередованием противоположно заряженных слоев модификаторов (ПДАДМАХ-цНЧЗ-ПДАДМАХ-цНЧЗ-БСА). СЭМ-снимки капилляра с пятислойным покрытием ПДАДМАХ-цНЧЗ-ПДАДМАХ-цНЧЗ-БСА свидетельствовали о наличии максимально плотного слоя модификатора на стенках капилляра. Кроме того, отмечена равномерность покрытия по всей длине капилляра. Увеличение плотности покрытия при увеличении числа слоев происходит за счет того, что каждый последующий слой модификатора заполняет свободные места предыдущих слоев. Полученное пятислойное ПДАДМАХ-цНЧЗ-ПДАДМАХ-цНЧЗ-БСА покрытие стабильно до 120 аналитических циклов. Показано, что полученные модифицированные капилляры обеспечивают полное разделение энантиомеров триптофана без введения БСА в фоновый электролит. Таким образом, наращивание числа слоев приводит не к увеличению толщины покрытия, а к его уплотнению и, соответственно, увеличению количества активных центров, участвующих во взаимодействии с аналитами. Оптическая активность и способность наращивать более толстые полимерные слои на поверхности капилляра делают перспективным использованием поли-L-лизина (ПЛЛ) в качестве связующего слоя при создании мультислойных покрытий для осуществления хирального разделения. Показано, что замена ПДАДМАХ на ПЛЛ для фомирования пятислойных покрытий обеспечивает генерирование более быстрого анодного ЭОП при рН < pI БСА и более быстрого катодного ЭОП при рН > pI БСА по сравнению с пятислойным покрытием с использованием ПДАДМАХ в качестве связующего слоя (ПДАДМАХ-цНЧЗ-ПДАДМАХ-цНЧЗ-БСА). Это послужило косвенным доказательством большей концентрации БСА на стенках капилляра в случае использования поли-L-лизина в качестве связующего слоя по сравнению с ПДАДМАХ. Полученные модифицированные капилляры с пятислойным покрытием (ПЛЛ-цНЧЗ-ПЛЛ-цНЧЗ-БСА) обеспечивают полное разделение энантиомеров триптофана без введения БСА в фоновый электролит. Также применение данных многослойных хиральных покрытий привело к частичному разделению энантиомеров пропранолола без введения добавок альбумина в фоновый электролит. Замена ПДАДМАХ на ПЛЛ в пятислойных покрытиях позволила уменьшить время модификации, увеличить чувствительность метода, улучшить разрешение энантиомеров и уменьшить концентрацию добавки БСА, необходимой для полного разделения энантиомеров пропранолола, в 2 раза.