Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Непрерывное использование невозобновляемых видов топлива и вызываемые ими выбросы токсичных газов порождают серьезные вопросы на глобальном уровне. Наилучший способ свести к минимуму данную проблему — заменить их на устойчивые ресурсы. В настоящее время лигноцеллюлозные культуры, которые являются наиболее распространенным доступным сырьем для производства биотоплива на Земле, используются для снижения этой зависимости. С одной стороны, применение пестицидов и удобрений привело к повышению урожайности, с другой стороны, они загрязнили почву тяжелыми металлами. Растения с высокой лигноцеллюлозной биомассой могут помочь во многих аспектах. Во-первых, они могут иммобилизовать металлы, изолируя их в корнях. Во-вторых, их биомассу можно использовать для приготовления биотоплива, а разлагаемую биомассу после ферментативного гидролиза можно превратить в биочар. Биочар представляет собой углеродистый материал с очень большой площадью поверхности, богатый макро- и микроэлементами, обладающий высокой способностью поглощать металлы. Он также является подходящим носителем для микроорганизмов. Пористая природа биочара значительно повышает выживаемость аэробных бактерий. Для усиления его эффекта на загрязненных металлами территорий, значительную помощь может оказать инокуляция биочара металлотолерантными ростостимулирующими ризобактериями (PGPR). Использованию металлотолерантных PGPR и биочара в синергии для улучшения лигноцеллюлозной биомассы посвящено ограниченное количество исследований. Более того, использование остатков гидролизата лигноцеллюлозной биомассы для получения биочара ранее никогда не изучалось. Кроме того, этот биочар можно дополнительно использовать в процессе ферментации для адсорбции/минимизации содержания металлов в конечном биоэнергетическом продукте. Данное исследование включает изучение влияния PGPR на четыре разновидности Amaranthus sp. (амаранта), которые в дальнейшем могут быть использованы для приготовления биочара методом непрямого пиролиза. Для проведения исследований были выбраны участки вблизи медеплавильного комбината на территории г. Карабаша (Челябинская область, Россия), сильно загрязненной тяжелыми металлами. Для выделения металлотолерантных PGPR были отобраны образцы ризосферой почвы двух доминирующих видов растений Sinapsis alba L. и Trifolium pratense L. Физико-химическое состояние почвы показало дефицит питательных веществ, слабокислые значения рН, плохие физические свойства, а также очень высокие концентрации Cu, Ni, Pb, Cr и Cd, которые превышали допустимые пределы для почвы. Общее бактериальное разнообразие ризосферной почвы было изучено с помощью секвенирования Metagenomic Illumina, которое продемонстрировало, что S. alba обладает более высоким полезным бактериальным разнообразием по сравнению с T. pratense, поэтому ризосферная почва S. alba была выбрана для дальнейшего выделения, идентификации и исследования чистых культур бактерий. Ризосферную почву серийно разбавляли на чашках с агаром с концентрацией меди 200 ppm для выделения устойчивых к металлам ризобактерий. Позже они были испытаны на максимальную устойчивость к металлам, таким как Cu, Pb, Cd, Ni и Cr; и из 25 изолятов 5, которые были способны переносить очень высокие концентрации металлов, были дополнительно проанализированы на PGP-способность и устойчивость к антибиотикам. Все пять изолятов продуцировали индолил-3-уксусную кислоту, солюбилизировали фосфаты кальция, продуцировали сидерофоры и АЦК-дезаминазу и проявляли устойчивость ко многим антибиотикам. Однако штамм SA10f показал наилучшие результаты по большинству PGPR-признаков и устойчивости к антибиотикам. Более того, поскольку только этот штамм продемонстрировал продукцию цианистого водорода, SA10f был признан подходящим для проверки его эффективности в отношении роста растений. Все пять штаммов были предварительно идентифицированы с помощью морфологического теста и окрашивания по Граму, а затем секвенированием гена 16s рРНК методом Сэнгера. Был проведен BLAST анализ, и последовательности были депонированы в генбанк NCBI для получения регистрационных номеров. Четыре разновидности амаранта, A. caudatus L. gibbosus alba, A. caudatus L. f. rubra, A. hypochondriacus L. и A. cruentus L. CV cherginskii выращивали в лотках для рассады. Через 15 дней роста рассаду пересаживали в большие горшки, оставляли расти до созревания при двух обработках, т.е. в контроле и с добавлением PGPR штамма SA10f. Эксперимент был проведен для получения высокой биомассы, которая использовалась на первом этапе производства биочара, чтобы в дальнейшем его использовать вместе с PGPR на второй стадии при выращивании растений, а также для адсорбции металлов из жидких продуктов биотоплива. Было отмечено, что биомасса свежих и сухих растений, длина побегов, количество листьев, площадь листьев, содержание пигментов значительно увеличились у растений, обработанных PGPR штамм SA10f, для всех изученных видов. Однако существенного влияния на содержание пролина по сравнению с контролем не наблюдалось. Максимальной биомассы достигал A. cruentus CV, за которым следовал A. caudatus f. rubra, и оба вида растения показали улучшенные биометрические параметры роста по сравнению с контролем и другими обработанными видами. Таким образом, можно предположить, что A. caudatus f. rubra и A. cruentus CV являются подходящими видами растений для производства более высокой биомассы в присутствии PGPR штамм SA10f. Анализ состава биомассы растений, обработанных PGPR, показал высокое содержание лигнина, сухого вещества и целлюлозы по сравнению с контрольными растениями с зольностью ниже 30%, что подтверждает ее пригодность для использования в качестве сырья для производства биотоплива. Высокая биомасса у всех четырех разновидностей амаранта дает возможность производить биочар путем его пиролиза в специальной реторте. Для этого стебли очищали, разрезали на кусочки размером 1 см, сушили и измельчали в мелкий порошок, который помещали в реторту в небольшие контейнеры из нержавеющей стали. Сухая древесина использовалась в качестве сырья для реторты для двухчасового пиролиза с непрямым нагревом. Реторту охлаждали и получали мелкодисперсный углеродистый биочар. Обнаружено, что биочар имеет щелочную природу, обладает высокой электропроводностью и водоудерживающей способностью. Биодоступное содержание металлов в биочаре было ограниченным/незначительным, ниже уровня токсичности и обнаружено, что он очень богат на содержание углерода и калия. Исследование с помощью сканирующей электронной микроскопии (SEM) показало высокопористую структуру всех четырех биочаров, полученных из амаранта, в то время как непиролизные образцы не имеют этой структуры и другие полезные характеристики. В целом ризосферная почва S. alba содержала значительное количество PGPR, и их использование улучшало биомассу растений амаранта за счет улучшения питательного статуса и физико-химических свойств почвы. Кроме того, применение PGPR также повышало содержание лигноцеллюлозы у всех изученных разновидностей амаранта. Биомасса с высоким содержанием лигноцеллюлозы была преобразована в биочар с высоким содержанием углерода (с высокой водоудерживающей способностью, с макро- и микроэлементами и ограниченной биодоступностью тяжелых металлов) с использованием реторты для пиролиза. Биочар является хорошим аккумулятором металлов, и его применение вместе с PGPR может улучшить биомассу растений за счет стабилизации металлов в почве и обеспечит получение сырья для производства биочара следующего поколения. Кроме того, повторное использование гидролизованных отходов биомассы, образующихся во время ферментации, для производства биоэтанола также может предоставить материал для производства биочара. На каждом последующем этапе выращивания уровень загрязнения будет снижаться, что приведет к доступности чистой биомассы для производства в будущем чистого биотоплива.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Выбросы ядовитых газов из-за использования исчерпаемых видов топлива остаются серьезной проблемой для всего мира. Несмотря на высокую распространенность лигноцеллюлозных культур, они до сих пор редко используются для производства биотоплива. Для увеличения лигноцеллюлозной биомассы широко используются минеральные удобрения, однако это приводит к загрязнению почвы металлами. Таким образом, для увеличения биомассы требуются более безопасные технологии. Поэтому большое значение имеет получение из растительной биомассы углеродсодержащего биочара. Из-за большой площади поверхности биочар поглощает металлы и удерживает их в своей пористой матрице. Кроме того, присутствие макро- и микроэлементов способствует росту растений и снижает транслокацию металлов в надземные органы. Биочар также обеспечивает подходящую среду для иммобилизации металлоустойчивых ризобактерий, способствующих росту растений (PGPR), и участвует в фитостабилизации маталлов. Однако необходима оценка их синергетического эффекта для улучшения лигноцеллюлозной биомассы, которая является основным источником сырья для производства биотоплива. Более того, никогда ранее не изучался гидролизованный лигноцеллюлозный остаток биомассы для получения биочара, который можно использовать во время ферментации для минимизации содержания металлов в конечном биоэнергетическом продукте. Отобранный ранее штамм PGPR Pseudomonas koreensis SA10b, выделенный из ризосферы Sinapsis alba L. в условиях полиметаллического загрязнения, показал высокую устойчивость к металлам и антибиотикам, наряду с многочисленными ростстимулирующими способностями. Биочар, полученный методом бескислородного пиролиза в специально сконструированной реторте с непрямым нагревом в первый год проведения исследований из разных сортов амаранта, выращенных на незагрязненной почве, был использован для вегетационных опытов 2-го года. Два подходящих сорта A. caudatus gibbosus alba (GA) и A. caudatus festuca rubra (FR) были отобраны для дальнейшего проведения модельных экспериментов в горшечных культурах. Биочар, полученный ранее из этих же сортов амаранта (BGA и BFR), использовали как самостоятельную добавку или как носителя PGPR. Для каждого сорта было четыре варианта с предварительным добавлением 25 мг Cd/кг почвы: контроль (торфяной субстрат); P. koreensis штамм SA10b; 1% BGA или BFR; и 1% BGA или BFR + SA10b. Через 75 дней вегетационного периода максимальное увеличение ростовых характеристик (длина побегов, количество листьев и их площадь, сырая и сухая биомасса) и содержания хлорофиллов a и b наблюдалось у обоих сортов амаранта в почве, обработанной соответствующим биочаром с добавлением PGPR, и выстраивалось: BGA (BFR) > PGPR SA10b > контроль. В то же время, обратный результат наблюдался для пролина, наименьшее содержание которого было обнаружено у обоих сортов, обработанных совместно BGA или BFR + SA10b. Сорт A. caudatus FR показал лучшие результаты, чем A. caudatus GA. Минимальное накопление Cd в стеблях амаранта было обнаружено в вариантах: BGA + SA10b (9,5 мг/кг сухого веса) и BFR + SA10b (6,2 мг/кг сухого веса). Результаты исследования показали, что биочар в сочетании с PGPR значительно снижал содержание Cd в побегах и увеличивал общую биомассу растений, которая затем была снова преобразована в биочар нового поколения. Изображения, полученные с помощью сканирующей электронной микроскопии с полевой эмиссией (FESEM-EDS), показали бактериальную ассоциацию в пористых структурах обоих биочаров. Высокая водоудерживающая способность, микропористая структура и макроэлементы в биочаре, способствовали аэрации почвы, накоплению питательных веществ и удержанию воды, тем самым улучшая выживаемость бактерий, которые были способны проявлять PGP-свойства. Результат анализа спектров EDS показал, что большая часть биочара состояла из углерода, затем кислорода, а также содержала небольшое количество кальция, магния и калия. Анализ с помощью инфракрасной спектроскопии с преобразованием Фурье (FTIR) для обоих полученных биочаров показал несколько полезных функциональных групп с разными волновыми числами в ИК-спектрах 400–4000 см^-1. BFR показал относительно более высокие ИК-сигналы, чем BGA, что подтверждает наличие большего количества функциональных групп на его поверхности. BFR показал более высокий пик для ароматических C–H, по сравнению с BGA. Присутствие фенольной группы –ОН наблюдалось у обоих биочаров, что может способствовать иммобилизации металлов, таких как Cd. Таким образом, FTIR дополнительно подтвердил эффективность применения обоих биочаров, полученных путем непрямого пиролиза из двух сортов амаранта, в дальнейших биоремедиационных исследованиях. Анализ биомассы стеблей обоих сортов амаранта показал значительное содержание гемицеллюлозы и целлюлозы, которое колебалось от 8,0–16,1% до 16,2–25,3%, соответственно, что делает их пригодными для производства биоэтанола. Содержание золы находилось в пределах 11–13%. Максимальная биомасса побегов обоих сортов A. caudatus была получена в варианте BGA (BFR) + SA10b; в дальнейшем она была использована в качестве сырья для последующего осахаривания. Предварительная обработка образцов 4% раствором NaOH в микроволновой печи (180 Вт) приводила к делигнификации биомассы и высвобождению целлюлозы и гемицеллюлозы, уменьшала их кристаллизацию и, таким образом, облегчала ферментативный гидролиз (смесью целлюлазных ферментов и β-глюкaназы) для осахаривания, что увеличивало производство жидкого сырья, богатого глюкозой, которое можно использовать для производства биотоплива в будущем. Общее содержание сахаров составляло 10 и 12 г/100 г сухой массы для A. caudatus сортов GA и FR, соответственно. Концентрация Cd после гидролиза биомассы A. caudatus сортов GA и FR снижалась до 2,1 и 1,7 мг/л фильтрата после добавления соответствующих биокомпозитов. Это показало, что биочар с высокой пористостью, наряду с имеющимися функциональными группами (о чем свидетельствует результат FTIR), может эффективно адсорбировать Cd из гидролизата. Лигноцеллюлозная гидролизованная твердая биомасса была высушена и дополнительно обработана для производства биочара в реторте для пиролиза собственной разработки. Таким образом, был получен биочар нового поколения с пониженным содержанием Cd, что позволило минимизировать отходы. В целом, применение PGPR SA10b наряду с биочаром, полученным из A. caudatus сортов GA и FR увеличивало их биомассу и снижало накопление Cd в надземной части, которая показала значительный процент гемицеллюлозы и целлюлозы. Поэтому она может быть использована в качестве сырья для будущего производства биоэтанола с минимизацией отходов путем получения вторичного биочара из твердого остатка гидролизата биомассы. Дальнейшее тестирование полученного из амаранта «чистого» биочара на другой сельскохозяйственной культуре – Brassica napus L. в вегетационных опытах показало достаточно высокую эффективность полученных биокомпозитов для улучшения роста и повышения устойчивости растений к действию Cd и засухи. Добавление в почву 2,5% биокомпозита BMC9, созданного на основе Pseudomonas sp. штамм ASe42b и биочара, произведенного из стеблей A. caudatus GA и FR, показало наилучший результат практически по всем изучаемым у B. napus морфофизиологическим параметрам. Благодаря применению этого композита, максимальное количество Cd сконцентрировалось в корнях с незначительным переносом в побеги, что делает B. napus потенциальной культурой, подходящей для произрастания на загрязненных Cd почвах в аридных и полуаридных условиях. Таким образом, можно сделать вывод, что A. caudatus является отличным источником лигноцеллюлозной биомассы, которую можно использовать для производства эффективного биочара, внесение которого в почву, наряду с металлотолерантными PGPR, будет способствовать фитостабилизации Cd на загрязненных сельскохозяйственных территориях и получать чистую надземную биомассу для будущего производства биотоплива, что, в конечном счете, может помочь в снижении загрязнения окружающей среды и стимулировать экономику России.