Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Выявление механизмов формировании устойчивости растений к неблагоприятным факторам среды является актуальной задачей современности. Чаще всего исследователи изучают в краткосрочных экспериментах реакции растений, вызванные стрессорами, на уровне изменения активности антиоксидантных ферментов. Значительно реже рассматриваются эффекты длительного воздействия стрессора, а также восстановление растений после снятия стрессового воздействия или уменьшении его интенсивности. Наша работа была направлена на восполнение этого пробела. В качестве объектов для работы были выбраны растения циннии и табака, которые являются традиционными модельными объектами в физиологии и биохимии растений (цинния – модель для изучения процессов лигнификации клеточных стенок). Стресс индуцировали хлоридом натрия или сульфатом меди. «Медный» стресс актуален для Уральского региона и других территорий, характеризующихся добычей медных руд и цветной металлургией, в то время как засоление – широкомасштабная проблема южных регионов нашей страны и других стран. Было изучено изменение содержания лигнина в растениях в ответ на стрессовое воздействие и в период восстановления после снятия действия стрессоров, изменение анатомических параметров корня и стебля, а также изменение активности пероксидаз III класса – гваяколовой (ГПО) и бензидиновой (БПО), вовлеченных в процесс лигнификации и утилизации АФК. Также было определено содержание фенольных соединений, являющихся антиоксидантами и субстратами для пероксидаз. Показано, что табак и цинния являются растениями исключателями ионов меди. Этот металл накапливался в корневой системе растений и мало транспортировался в побег. Одним из негативных эффектов ионов меди являлось ограничение роста корня в длину, что было показано для растений табака в присутствии 300 μM CuSO4 в среде. Как у растений табака, так и у циннии выявлено утолщение корня в зоне проведения за счет увеличения диаметра стели и коры. Это подтверждает барьерную функцию корневой системы. При длительном культивировании растений табака и циннии на субстратах с добавлением умеренной дозы сульфата меди (100 μM CuSO4) был отмечен стимулирующий эффект: увеличивались размеры и масса побегов у обоих видов. У растений табака и циннии в условиях длительной обработки субстрата сульфатом меди и в период последействия стрессора утолщение стебля происходило за счет увеличения доли проводящей системы и доли ксилемы в сосудистых пучках. Иной эффект на рост и анатомические параметры растений циннии оказывало засоление среды. Цинния – гликофит: при солевом стрессе (50 мМ) биомасса, длина побега и площадь листьев были меньше в сравнении с контролем. На 20 день роста наблюдали утолщение корня в зоне проведения и стебля за счет увеличения толщины коры и стели. В стебле количество лигнифицированных элементов в сосудистых пучках уменьшалось в сравнении с контролем. При длительном действии CuSO4 и в постстрессовый период у циннии рост содержания лигнина был сильнее выражен в корнях, чем в стебле. Увеличение количества лигнина в корне растений приводило к уменьшению площади сосудов ксилемы. В стебле при стрессе содержание лигнина также возрастало, а после 10-дневного периода восстановления растений было сопоставимо с контролем. Изменение суммарного содержания лигнина было обусловлено, главным образом, за счет увеличения лигнина Класона. Напротив, в условиях засоления происходило снижение общего содержания лигнина в корнях циннии за счет уменьшения количества лигнина Класона, а доля кислоторастворимого лигнина возрастала при стрессе относительно контроля. В стебле количество лигнина Класона при засолении среды возрастало. Фенольные соединения могут выполнять роль антиоксидантов, являются предшественниками лигнина, то есть их содержание в органах растений может определяться разными факторами. У растений табака суммарное содержание фенольных соединений в корне мало изменялось при стрессе, а у восстанавливающихся после стресса растений снижалось. В стебле при стрессе их содержание возрастало, а после восстановления растений уменьшилось в сравнении с контрольной группой растений. У циннии содержание фенольных соединений с возрастом в контроле возрастало как в корнях, так и в стебле. После 20-дневного медного стресса в корнях и стеблях наблюдали снижение содержания фенольных соединений, что отрицательно коррелировало с увеличением количества лигнина Класона в тканях. Напротив, в период последействия происходило увеличение количества фенольных соединений в корне и стеле растений. Иные эффекты выявили при засолении среды. На 20 день роста содержание фенольных соединений при стрессе в корне циннии мало изменялось, а в стебле возрастало. У растений табака общая активность ассоциированных с клеточной стенкой ГПО и БПО была высокой в корне и минимальна в листьях во всех вариантах опыта. Схожая картина была характерна для цитозольной БПО. В целом БПО была в 2 и более раза активней, чем ГПО. Стресс в 2–5 раз активировал цитозольную ГПО в корне. Увеличение активности ГПО и БПО было связано с усилением активности существующих изоформ. Гистохимическое окрашивание тканей показало, что на этапе образования вторичной клеточной стенки в корне табака БПО была локализована в ризодерме, первичной коре, клеточных стенках сосудов ксилемы. ГПО была локализована в ризодерме и ксилеме корня, в стебле – в эпидермальных слоях и хлорофилл-содержащих слоях первичной коры табака. Таким образом, ГПО и БПО отличались гистохимической локализацией. Возможно, лигнификация сосудов метаксилемы протекает при участии БПО и ГПО, а механических тканей – только при участии ГПО. У растений циннии при медном стрессе активность БПО и ГПО в тканях корня и стебля на 20 день увеличивалась. Увеличение активности ГПО в корне и стебле происходило также в период восстановления растений после снятия стрессового фактора. Усиление биосинтеза фенольных соединений как низкомолекулярных антиоксидантов, увеличение количества пероксида водорода и рост активности пероксидаз могли инициировать лигнификацию клеточных стенок. ПААГ-электрофорез выявил 6 изоформ пероксидаз. Две наиболее легкие формы были характерны для надземных органов – встречались в стебле и листе, но отсутствовали в корне. Их активность увеличивалась в ответ на действие стрессора. Горизонтальный электрофорез белков в агарозе позволил отличить катионные и анионные формы пероксидаз. Обнаружены катионные изоформы, характерные только для осевых органов, при этом имеющие в контрольных условиях большую активность в стебле, чем в корне. В ответ на действие ионов меди активность данных изоформ в корне возрастала, а в стебле падала. В корнях, стеблях и листьях циннии при засолении активность БПО возрастала в сравнении с контролем. В период восстановления она мало менялась и оставалась на уровне, близком к исходному контрольному. Во всех органах циннии при стрессе и после снятия стрессового воздействия происходило увеличение активности ГПО в сравнении с контролем. В условиях солевого стресса, так же, как и при действии ионов меди, при электрофоретическом разделении белков обнаружены изоформы пероксидаз. Наиболее тяжелая форма является конститутивной, присутствует во всех органах как при стрессе, так и в контроле. Выявлена изоформа, характерная для надземных осевых органов. В корне она индуцировалась только при засолении. Анализ катионных форм показал, что в корне и стебле есть 2 высокоактивных специфичных для осевых органов изоформы ГПО. При обоих видах стрессового воздействия (избыток сульфата меди, засоление) растения табака и циннии неспецифически отвечали усилением лигнификации осевых органов. Это является следствием увеличения активности пероксидаз III класса. Несмотря на сходство субстратов ГПО и БПО, гистохимически показаны различия в их локализации. Методом электрофореза в ПААГ и агарозном геле выявлены органоспецифичные изоформы ферментов. С возрастом и при стрессе показано повышение активности одних и тех же изоформ пероксидаз.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Избыток тяжелых металлов и засоление почвы – серьезные экологические проблемы. Растения ограничивают действие стрессоров посредством различных механизмов, включая генетические, эпигенетические, биохимические, анатомические, морфологические и онтогенетические изменения. Когда растение впервые сталкивается со стрессором, оно в первую очередь реагирует изменением своего метаболизма. Метаболические характеристики растений изучают как правило в краткосрочных лабораторных экспериментах. В длительном эксперименте можно выявить изменения метаболизма – акклимации, в том числе состава и количества различных первичных и вторичных метаболитов. Кроме того, растения могут изменять анатомию и морфологию своих органов под воздействием стресса. Поэтому, мы изучали влияние засоления среды и избытка меди в длительном эксперименте [1]. В качестве объектов для работы были выбраны растения циннии и табака, которые являются традиционными модельными объектами в физиологии и биохимии растений (цинния – модель для изучения процессов лигнификации клеточных стенок [2]). Целью настоящего исследования было выявить изменение количества и спектра фенольных соединений и лигнина в растениях в условиях стресса, вызванного избытком меди [1] и засолением среды [3], а также экспрессии генов, которые кодируют ферменты фенилпропаноидного пути и синтеза лигнина. Синтез фенольных соединений играет важную роль в устойчивости растений к стрессору, поскольку они действуют как сигнальные молекулы и антиоксиданты, являются предшественниками лигнина и способны хелатировать ионы металлов. У табака общее содержание свободных фенолов в корне и стебле при избытке меди снижалось за счет их участия в лигнификации тканей. В корнях и побегах табака соотношение гидроксикоричных кислот как предшественников лигнина среди связанных фенолов изменялось в ответ на длительное воздействие сульфата меди. Увеличение количества феруловой, коричной и p-кумаровой кислот в тканях корня в ответ на избыток меди можно считать маркерами процесса лигнификации. В наших опытах увеличение доли этих кислот в общем пуле фенольных соединений было сильнее выражено в корне, чем в других органах табака, что усиливало барьерную функцию этого органа [1]. В ответ на засоление среды усиление лигнификации тканей корня также сопровождалось уменьшением содержания свободных фенольных соединений [3]. В ответ на стрессовое воздействие разнообразие идентифицированных соединений в стебле и корне увеличивалось, в то время как в листе практически не менялось. В ответ на засоление в стебле увеличивалось содержание р-кумаровой, феруловой, сиреневой кислот и кверцетина не зависимо от действующей дозы хлорида натрия. В корне эти соединения обнаруживались только при действии 50 мМ хлорида натрия. Таким образом, реакции стебля на засоления не зависят от дозы токсиканта, тогда как у корня отличаются при действии 25 и 50 мМ хлорида натрия. В ответ на стрессовое воздействие начинают синтезироваться низкомолекулярные антиоксиданты, а также фенольные кислоты, которые могут выступать в качестве антиоксидантов, а также использоваться на синтез лигнина. При длительном избытке сульфата меди в среде у растений циннии на фоне усиления процессов лигнификации в опыте уменьшалось количество феруловой кислоты. Наибольшее содержание этого метаболита было выявлено в корне в сравнении с побегом в контроле [4, 5]. Усиление синтеза фенольных соединений как предшественника лигнина был обусловлен увеличением относительного количества транскриптов генов CAD и 4CL в корне, PAL, 4CL, CAD в стебле в ответ на длительное действие избытка сульфата меди в среде. В ответ на засоление у растений циннии выявили отсутствие салициловой кислоты и увеличение количества феруловой кислоты, при сохранении стабильного спектра флавоноидов. Увеличение количества свободных фенольных соединений в стебле циннии было обусловлено увеличением относительного количества транскриптов генов C4H, 4Cl и CAD. Были изучены физиологические реакции растений табака на длительное засоление среды. Было выявлено, что табак – гликофит: при солевом стрессе (25 и 50 мМ) общая биомасса растений, длина главного корня и стебля, площадь листьев были меньше в сравнении с контролем. При стрессе с 50 мМ NaCl происходило уменьшение диаметра корня в зоне проведения и стебля за счет уменьшения доли стели в варианте с обработкой. Стресс привел к уменьшению активности пероксидаз III класса – бензидиновой и сирингалдазиновой в этом варианте опыта. В листьях активности пероксидаз III класса уменьшалась. ПААГ-электрофорез выявил 7 изоформ пероксидаз. Две наиболее тяжелые формы были характерны только для тканей корня, их активность усиливалась при длительном засолении среды. Напротив, активность «легких» изоформ уменьшалась в условиях стресса. И после периода восстановления, и в условиях длительного внесения в субстрат хлорида натрия не выявлено появления новых изоформ пероксидаз III класса. В тканях листьев уменьшалась активность «легких» изоформ пероксидаз в вариантах опыта с длительной обработкой субстрата растворами хлорида натрия. Горизонтальный электрофорез белков в агарозе позволил отличить катионные и анионные формы пероксидаз. Было выявлено увеличение активности катионных изоформ пероксидаз в тканях корня. В тканях стебля отметили усиление активности анионных изоформ в сравнении с контролем в варианте опыта с предобработкой субстрата 50 мМ NaCl. В листьях активности анионных изоформ пероксидаз уменьшалась. Более подробно о нашей работе: 1. https://www.mdpi.com/1422-0067/24/20/15129 2. https://www.mdpi.com/2311-7524/9/3/410 3. https://elib.sfu-kras.ru/handle/2311/150838?ysclid=lq18z2fvu4394012021 4. https://naked-science.ru/article/column/tsinnii-pomogut-sdelat-selhozkultury 5. https://scientificrussia.ru/articles/ucenye-vyavili-geny-otvecausie-za-krepkuu-nozku-u-rastenij