Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Создание средств визуализации и одновременного фото- и термовоздействия на раковые клетки является значимой научной проблемой. Настоящий проект посвящен разработке бимодальных оптических меток для биовизуализации раковых клеток методами флуоресцентной и КР микроскопии, позволяющих одновременно проводить локализованную гипертермальную терапию с использованием медицинских лазеров 633 и 785 нм. По результатам первого этапа проекта разработаны бимодальные метки на основе анизотропных наночастиц золота с максимумом полосы поглощения от продольной моды локализованного плазмонного резонанса в области 720-760 нм. Конкретными составляющими созданных оптических меток являются: наночастицы золота стержневидной формы, производные цианина 5.5, оболочка из биосовместимых материалов (оксид кремния, полиэлектролиты) и модельный вектор доставки – фолиевая кислота. За первый год проекта получен широкий набор меток по типу «ядро-оболочка», отличающихся аспектным соотношением золотого ядра, составом оболочки, положением хромофора в ней и способом иммобилизации хромофора (ковалентная конъюгация, электростатическая адсорбция и однореакторная инкорпорация). Все системы охарактеризованы методами просвечивающей электронной микроскопии, динамического светорассеяния, спектроскопии поглощения. Спектральные исследования меток методами Гигантского комбинационного рассеяния (ГКР) и флуоресцентной спектроскопии выполнены как для коллоидных растворов, так и для инкубированных клеточных образцов. Путем вариации структуры и состава меток подобраны оптимальные параметры, при которых метки способны работать в бимодальном режиме, что продемонстрировано полученными люминесцентными и КР изображениями клеточных образцов. Отказ от ковалентной конъюгации красителя и его расположение на расстоянии 2-3 нм от ядра являются ключевыми факторами достижения бимодальности. Биологические испытания, проведенные на клеточных линиях HeLa, PANC-1, HEP G2, показали, что разрабатываемые метки на основе наночастиц золота претерпевают эндоцитоз вне зависимости от морфологии ядра и материала покрытия и находятся в везикулах, которые локализованы в цитоплазме. Тесты на цитотоксичность показали, что метки не токсичны в диапазоне концентраций по атомарному золоту вплоть до 5 мг/л. По результатам количественной оценки эндоцитоза определено, что поглощение клетками полученных меток с оболочкой из полиэлектролитов и поверхностью, модифицированной фолиевой кислотой, составляет 40-60% от исходной концентрации. Результаты работы в целом свидетельствуют о высоком биомедицинском потенциале разрабатываемых меток. По результатам выполнения 1 этапа проекта опубликовано 4 статьи, индексируемые в Scopus и WoS, из которых 3 опубликованы в журналах с квартилем Q1, подготовлено 4 устных и 3 стендовых доклада на международных и всероссийских конференциях.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Работы второго года проекта разделились на три направления: 1) получение, спектральное исследование и апробация меток биовизуализации на основе ацетиленовых соединений; 2) получение, спектральное исследование и апробация плазмонных меток биовизуализации с бимодальным ГКР-флуоресцентным откликом, возбуждаемым на одной длине волны; 3) отработка методик конъюгации моноклональных антител к структурам ядро-оболочка на основе наночастиц золота. В рамках выбора молекулы-репортера для разрабатываемых плазмонных меток изучен широкий ряд алкинов, в том числе производные флуорофоров (BDP 650/665 алкин, цианин 5.5 алкин и др.), биоактивных молекул (биотин алкин, 5-этинилуридин и др.), соединения на основе толанов (дифенилацетиленов), диэтинилтриазолов и этинилпиридинов. По совокупности характеристик (интенсивность сигнала тройной связи в спектре ГКР, растворимость в воде или диметилсульфоксиде, цитотоксичность) аминотолан выбран в качестве КР репортера. Путем ковалентной конъюгации аминотолана к поверхности золотых наночастиц получены плазмонные ГКР метки, обладающие линейной зависимостью спектрального отклика от концентрации золота в диапазоне 10-55 мг/л и позволяющие осуществлять визуализацию отдельных клеток. В рамках второго направления по разработке бимодальных агентов биовизуализации получены КР-флуоресцентные метки, состоящие из золотых наночастиц костеообразной формы и цианина 5.5, покрытые биосовместимой оболочкой и функционализированные фолиевой кислотой в качестве модельного вектора доставки. Показано, что данные метки обладают мономодальным флуоресцентным откликом при возбуждении лазером с длиной волны 633 нм и бимодальным ГКР-флуоресцентным откликом при возбуждении лазером с длиной волны 785 нм. На основании оценки удельной площади поверхности и оптического отклика полученных меток рассчитано, что одна метка обеспечивает сигнал эмиссии в 550 раз больший по сравнению с одной молекулой флуорофора. Для обоих видов полученных плазмонных меток биовизуализации и с аминотоланом и с цианином 5.5 установлены периоды агрегативной и седиментационной устойчивости, составившие более 6 месяцев, и на основе МТТ тестов верифицирована потенциальная биосовместимость. В рамках клеточных тестов также проведена оценка лазерно-индуцированной гибели клеток вследствие фототермического эффекта плазмонных меток. Установлено, что при непрерывном освещении источником с длиной волны 650 нм и плотностью мощности 11 мВт/см2 на образце 15 минут облучения приводят к гибели 30 % клеток, в течение 40 % - минут к гибели 40% клеток. Повышение адресности разрабатываемых меток является важной задачей, решение которой будет способствовать значимому росту их эффективности. Поэтому отдельные работы 2 этапа проекта были посвящены отработке методики конъюгации антител к исследуемым структурам ядро-оболочка на основе наночастиц золота. Конъюгация антител к наночастицам золота осуществлялась в несколько стадий: 1) функционализация наночастиц золота поликарбоксилами; 2) активация карбоксильных групп на поверхности наночастиц; 3) проведение реакции аминолиза при добавлении антител. На основании апробации поликислот с варьируемой природой мономерного звена и молекулярной массой выявлено, что полиаспарагиновая и полиакриловая кислоты лучше подходят для карбоксилирования поверхности золота, так как не приводят к самопроизвольной коагуляции наночастиц в буферах для биохимии MES и Трис. На основании количественного анализа по методу Бредфорда установлено, что предложенная методика конъюгации антител к золотым наночастицам обеспечивает конверсию антител в 85 %. По результатам 2 года проекта опубликовано 3 статьи, 1 принята к печати, сделано 5 докладов (4 устных и 1 стендовый) на конференциях, подготовлена 1 ВКР бакалавра.